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九江八河范文第1篇

2、二龍戲珠,二人同心,二三其德,二八佳人

3、三陽開泰,三從四德,三山五岳,三頭六臂

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5、五光十色,五顏六色,五福臨門,五洲四海

6、六六大順,六月飛雪,六畜興旺,六出奇計

7、七步之才,七步成詩,七日來復,七長八短

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九江八河范文第2篇

【摘要】 p300是一種具有組蛋白乙酰化酶活性的轉錄輔助因子，HDAC1是一種組蛋白去乙酰化酶。本研究查明姜黃素對B-NHL細胞株Raji細胞增殖的影響，并探討這種影響與p300以及HDAC1轉錄調節表達的關系。 以不同濃度(6.25-50 μmol/L)的姜黃素作用于體外培養的Raji細胞，用MTT法檢測細胞生長抑制率，Annexin-V-FITC/PI雙標流式細胞術檢測細胞的凋亡率和應用RT-PCR 和Western blot法檢測Raji細胞中HDAC1和p300的mRNA表達和蛋白含量的變化。結果表明： 姜黃素對Raji細胞抑制作用呈明顯的時效和量效關系。24小時的IC50為25 μmo/L；姜黃素能夠誘導Raji細胞凋亡，凋亡率為14.38%-61.18%，并呈濃度依賴性。姜黃素明顯抑制HDAC1和p300的活性和表達。在IC50濃度時，隨著時間的延長，其p300和HDAC1 mRNA表達和蛋白含量逐漸降低，呈時間依賴性，與對照組相比有顯著性(P

【關鍵詞】 B淋巴瘤

Regulatory Effect of Curcumin on p300 and HDAC1 in B-NHL Cells

Abstract The purpose of this study was to investigate the effect of curcumin on proliferation of B-NHL Raji cell line and explore the relationship between this effect and regulatory expression of p300 and HDAC1 transcription.The in vitro cultured Raji cells were treated with curcumin at various concentrations (6.25-50 μmol/L) and at different time points (0，6，12，24 and 48 hours)，the inhibitory ratio of cell growth was measured by MTT assay，the cell apoptosis rate was detected by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI double staining，the changes of p300 and HDAC1 mRNA expression and protein level in Raji cells were determined by RT-PCR and Western blot.The results showed that the curcumin could inhibit Raji cell proliferation in significant time-and concentration-dependent manners，IC50 at 24 hours was 25 μmol/L; the curcumin could induce apoptosis of Raji cells in concentration-dependent manner，apoptosis rate was 14.38%-61.18%.The curcumin significantly inhibited activity and expression of p300 and HDAC1.At IC50 concentration，expression of p300 and HDAC1 mRNA and protein level decreased with time-dependent manner，difference between tested and control groups was significant (P

Key words curcumin; B-NHL; Raji cell; p300; HDAC1

姜黃素(curcumin，Cur)是從姜黃根莖中提取的一種酚性色素，其藥理作用特性有抗炎、抗腫瘤、抗動脈硬化、抗病毒等。體外研究表明，姜黃素抑制癌細胞增殖和誘導凋亡是通過多條通路和調節多種腫瘤表面標記因子實現的，而且其作用靶點可以從DNA、mRNA到蛋白質水平［1］。

p300是一種重要的組蛋白乙酰基轉移酶，它能乙酰化核心組蛋白N末端的賴氨酸殘基使核小體組蛋白與DNA的結合穩定性下降，進而使轉錄機器與染色體的結合成為可能［2］。在細胞中可與多種基因轉錄活化因子結合而形成輔化因子復合體。除乙酰化作用外，p300還可以在轉錄起始復合體的形成中起支架或橋梁的作用［2］。目前研究表明，在多種腫瘤中p300可發生多種形式的基因突變，提示

p300具有促進基因轉錄的作用［3］。

組蛋白乙酰化酶(HAT)和組蛋白去乙酰化酶(HDAC)在真核細胞基因的轉錄調控中發揮重要的作用，調節核內蛋白質的乙酰化水平與基因轉錄。近年來研究發現，HAT/HDAC活性紊亂會使基因表達失控，從而導致癌癥的發生［4］。

本研究查明姜黃素對Raji細胞組蛋白去乙酰化酶HDAC1的作用，觀察轉錄共激活因子p300的表達情況，探討姜黃素抗腫瘤的分子機制。

材料和方法

材料

藥物

姜黃素，購自Sigma公司，純度>99%，溶解于二甲亞砜（DMSO），分裝備用。

細胞系

B細胞淋巴瘤細胞株Raji細胞購自上海科學院細胞中心。在含有10%的胎牛血清、青霉素100 U/ml及鏈霉素100 U/ml的RPMI 1640培養液中37℃、5% CO2條件下培養。每48小時換液傳代1次。取生長良好、細胞活性大于98%的細胞進行實驗。

主要試劑

RPMI 1640培養液(Gibco產品)，胎牛血清(中山凌飛公司產品)，溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT，Sigma產品) 組蛋白去乙酰化酶HDAC1抗體，p300抗體均購自Santa Cruze公司，其中HDAC1為鼠抗人單克隆抗體，p300為兔抗人多克隆抗體，羊抗鼠及兔抗鼠二抗和Bio-Rad蛋白定量試劑盒、TRIzoL均購自晶美公司。

方法

細胞培養

將Raji細胞接種于含10%滅活胎牛血清的RPMI 1640培養液中，在5% CO2、37℃、飽和濕度下培養，每2天換液1次，取對數生長期的細胞進行實驗，分別用不同濃度的姜黃素處理細胞，未加藥組為對照組。根據MTT法測得的姜黃素對Raji細胞作用的IC50為25 μmol/L，并用IC50濃度的姜黃素作用0、6、12、24及48小時，檢測HDAC1和p300蛋白及mRNA的變化。

細胞體外生長活性檢測

采用溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)比色法，取對數生長期的Raji細胞進行實驗，將不同濃度的姜黃素6.25-50 μmol/L加入10% FCS的RPMI 1640完全培養液中，調細胞濃度為5×105/ml，接種于96孔板，每種藥物濃度為一組，每個濃度設3個平行孔，置5% CO2、37℃培養箱培養不同時間(0、6、12、24及48小時)后，每孔加MTT 20 μl，培養4小時，棄MTT，每孔加二甲亞砜150 μl，充分溶解。選擇490 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔A值。腫瘤細胞的生長抑制率=（1-實驗組平均A值/對照組平均A值）×100%。

細胞凋亡的流式細胞儀檢測

用Annexin-V-FITC及PI雙標流式細胞儀檢測細胞凋亡，分為實驗組和陰性對照組。分別加入終濃度為6.25-25 μmol/L的姜黃素作用于24小時，用70%乙醇4℃固定24小時，PBS緩沖液洗去固定液，離心去上清。用緩沖液37℃孵育60分鐘，195 μl細胞懸液加5 μl Annexin-V-FITC。混勻，室溫放置10分鐘。用緩沖液洗滌細胞1次，在190 μl緩沖液重懸，然后再加10 μl 20 μg碘化丙錠。上流式細胞儀檢測。

p300及HDAC1 mRNA表達的RT-PCR檢測

細胞總RNA抽提及RT-PCR　步驟按TrizoL (Gibco公司)試劑盒說明書進行，所提取的總RNA溶解后用紫外分光光度儀測RNA純度和濃度(A260/A280>1.8)。在GenBank檢索基因cDNA序列，自行設計PCR引物，由上海生物工程公司合成。p300引物序列(上游引物: 5′-GGGCTCAACCGACAA GAC-3′，下游引物: 5′-GGAGGCAGAGGCAATCAA-3′，擴增產物為259 bp。β-actin引物序列上游引物:5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG-3′；下游引物: 5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，擴增產物為312 bp。PCR擴增條件為：94℃ 30秒，94℃ 變性1分鐘，57℃復性 30秒，72℃ 50秒，72℃延伸10分鐘，共進行35個循環。HDAC1引物序列(上游引物: 5′-AGTGCGGTGGTCTTACA GTG-3′，下游引物: 5′-TCTCCCTCCTCTTCAGAATCG-3′，擴增產物為500 bp。β-actin上游引物:5′-TGAGACCTTCAACACCCCAG3-′；下游引物: 5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTC-3′，擴增產物為316 bp。PCR擴增條件為：94℃ 5分鐘，94℃ 變性1分鐘，50℃復性 1分鐘，72℃ 延伸1分鐘，共進行32個循環。產物用1%的瓊脂糖膠，進行檢測。用數碼凝膠圖象分析系統（Kodak EDAS290）作條帶密度掃描，結果以目的條帶與對應的β-actin密度值表示。

轉貼于

細胞蛋白質樣品制備及蛋白定量

經處理后的細胞立即棄去培養液，洗滌，離心。加預冷的細胞裂解液(0.1 mol/L NaCl，0.01 mol/L Tris HCl，pH 7.6，0.001 mol/L EDTA，100 μg/ml PMSF，2 μg/ml leupeptin) 0.1 ml，裂解30分鐘，然后10 000×g離心10分鐘，取上清備用。以上所有操作均在4℃下進行。測定蛋白，并調各組蛋白濃度一致。

Western blot檢測

按文獻[5］報道的Western blot方法檢測p300，HDAC1其中一抗為鼠抗，二抗用辣根過氧化物酶(HRP)標記羊抗鼠IgG，經化學發光法，X線曝光顯影，軟件進行掃描定量，每個濃度組重復3次，取均值代表測定結果。

統計學分析

應用Excel 2000軟件作方差分析和t檢驗。

結果

Raji細胞生長抑制率的測定

姜黃素以時間劑量依賴性方式抑制Raji細胞增殖，6、12、24和48小時后，細胞抑制率分別如下：6.25 μmol/L時為(1.25±0.7)%、(6.79±0.9)%、(18.25±1.0)%、(23.15±1.9)%；12.5 μmol/L時為(4.28±0.6)%、(15.24±1.4)%、(30.25±2.0)%、(40.12±1.0)%；25 μmol/L時為(10.25±1.1)%、(29.14±2.3)%、(51.25±2.8)%、(63.58±2.9)%；50 μmol/L時為(17.25±2.0)%、(45.78±2.7)%、（63.58±3.5)%、(78.63±3.6)%，差異有顯著性意義(P

Raji細胞凋亡率的變化

細胞凋亡率隨姜黃素濃度增高而逐漸增加，兩種濃度（12.5和25 μmol/L）的藥物與對照組比較均能明顯誘導細胞凋亡(P0.05)（附表）。Table. Apoptosis ratio of Raji cells (%) inducted by various concentration of curcumin at 24 hours（略）

姜黃素對Raji細胞p300及HDAC1 mRNA表達的影響

姜黃素IC50濃度時，光密度掃描顯示第6小時的HDAC1和p300 mRNA表達已經下降，隨著時間延長，表達逐漸降低，呈時間依賴性（圖2）。

姜黃素對Raji細胞p300及HDAC1蛋白表達的影響

姜黃素IC50濃度處理Raji細胞6小時后p300和HDAC1蛋白表達開始下降，隨著作用時間的延長，其表達呈時間依賴性降低(圖3)。

討 論

姜黃素(curcumin，cur) 系從中藥姜黃中提取的酚性色素，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降血脂等廣泛的藥理作用，最近美國國立腫瘤所(NCI)將其列為第三代防癌藥物，進行臨床研究。大量資料證明，姜黃素能直接抑制腫瘤細胞的長，并能誘導細胞的凋亡，其作用機制主要是調控癌基因和抑癌基因［6，7］。此外，姜黃素還能抑制人類免疫缺陷病毒Ⅰ型和細胞有絲分裂的產生及抑制核轉錄因子NF-κB和AP-1的活性［8］。本實驗通過細胞增殖實驗研究姜黃素的抗腫瘤的機制，結果表明姜黃素能有效抑制Raji細胞增殖，誘導其發生凋亡，且呈明顯的量效關系和時間依賴性，與文獻報道一致［9］。

p300是一種具有組蛋白乙酰化酶活性的轉錄因子，對重要生物功能如細周期調控、細胞分化、凋亡等具有重要作用［10］。p300的一個特征是具有HAT的活性，通過募集p300相關輔助因子(PCAF)對靶組蛋白進行乙酰化，多種轉錄因子的乙酰化調節都與p300有關。Xiao等［11］發現，p300是HDAC抑制劑TSA誘導和SP1介導的P21WAF1轉錄所必需的，p300共轉染可升高P21WAF1啟動子活化，而且可以導致P21WAF1相關蛋白H3和H4高乙酰化。研究表明，在急性白血病、乳腺癌、肝癌和直腸癌中p300可發生多種形式的基因變異［3］。姜黃素作為一種新型、低效的抗癌藥物，作用于生物體細胞時，細胞內的p300的表達水平如何變化？本研究結果發現，姜黃素 IC50濃度以時間依賴作用抑制Raji細胞p300的表達，最早在12小時時即顯示對p300的抑制作用，48小時時抑制水平最高。RT-PCR檢測發現，p300 mRNA和蛋白水平顯著下降，提示姜黃素可能是通過下調p300 mRNA的表達及阻斷其蛋白產物抑制細胞增殖，誘導其凋亡細胞，其發生的機制可能是通過阻斷p300的轉錄激活，降低誘導基因表達，從而抑制腫瘤細胞生長。

組蛋白乙酰化/去乙酰化修飾是基因轉錄調控的關鍵機制之一。真核細胞內細胞內組蛋白乙酰化酶(histone acetylase，HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC1)活性的平衡調控核小體核心組蛋白的乙酰化水平及相關基因的轉錄活性。HAT/ HDAC1活性紊亂則會使基因表達失控，從而導致癌癥的發生。白血病細胞中由于染色體異位募集HDAC，導致不適當的組蛋白去乙酰化而使基因表達受抑和白血病發生［12］。有研究表明，急性白血病細胞染色體移位產生融合基因PML-RARα和AML-ETO，兩者編碼產生的融合蛋白可以募集HDAC，抑制分化基因的轉錄和表達，細胞分化成熟受阻，導致惡性增殖。維甲酸誘導急性早幼粒細胞白血病細胞分化時，可以使HDAC1從被募集位點解離，沉默基因得以表達，從而誘導細胞分化。抑制HDAC活性，也抑制了組蛋白的去乙酰化作用，核小體組蛋白乙酰化水平升高，染色體結構松弛有利于轉錄因子與DNA的結合，基因表達增強［13］。有研究表明，HDAC1可通過抑制hTERT mRNA的表達來下調端粒酶的活性，而端粒酶的活性與腫瘤細胞的永生化密切相關，進而證明HDAC1在腫瘤細胞中存在高表達［14］。本研究發現，姜黃素IC50濃度作用Raji細胞12小時可見HDAC1 mRNA及蛋白水平降低，而且持續48小時以上，說明組蛋白的去乙酰化得到阻止，可能是組蛋白乙酰化水平直接影響腫瘤的進程，而姜黃素可以誘導多種腫瘤細胞的生長停滯和分化，進而證明了組蛋白去乙酰化在腫瘤發生預防中的作用。這提示姜黃素抑制HDAC1的表達可能導致體內許多細胞增殖關鍵性基因轉錄降低。

本研究發現，姜黃素能夠抑制p300及HDAC1的表達，而且呈時間依賴性，說明姜黃素是通過多種途徑抑制腫瘤細胞增殖、誘導分化和凋亡的。因此，我們認為姜黃素可以通過抑制p300及HDAC1活性，誘導組蛋白高乙酰化，調節基因表達，從而發揮抗癌效應，是一種新型抗腫瘤治療的新的分子靶向藥物。

【參考文獻】

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