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細胞生物學特性范文第1篇

關鍵詞：5-aza-dc；延邊奶山羊；細胞活率；細胞形態；細胞凋亡

中圖分類號：S827 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）12-2862-04

Effect of 5-aza-dc on the Biological Characteristics of Yanbian Dairy Goat Ear Fibroblast Cell

CAI Li-juan，YIN Duo，ZHUANG Li-li，FNAG Nan-zhu，LI Zhong-shu

（Animal Genetic and Breeding Reproduction Laboratory， Agricultural College， Yanbian University， Yanji 133002，Jilin，China）

Abstract： To research the effects of DNA methylation inhibitor 5-aza-dc on biological characteristics of Yanbian dairy goat ear fibroblast cell， MTT method was used to determine the optimal action concentration and time of 5-aza-dc on Yanbian dairy goat ear fibroblast cells. PI and Hochest33342 double staining， agarose gel electrophoresis were used to detect apoptosis of the cells； and karyotype analysis to measure the effect of 5-aza-dc on the chromosomes. The results showed low concentration（≤0.010 μmol/L） of 5-aza-dC treatment for 72 h had little effect on the cells. With the increasing of concentration， cell morphology， viability， apoptosis and chromosomes were all significantly affected. The best processing time of 5-aza-dc was 72 h， low concentration of 5-aza-dc did not lead to apoptosis and karyotype change.

Key words： 5-aza-dc； Yanbian dairy goat； cell morphology； cell viability； cell apoptosis

體細胞核移植是哺乳動物胚胎工程的主要組成部分，也一直是研究的熱點。然而核移植研究中仍然存在著許多問題，如核移植效率低、胚胎發育異常、流產、畸形等。大量研究表明，體細胞核移植所用的供體細胞（成纖維細胞、顆粒細胞等）都是高度分化的細胞，具有較高的甲基化水平，在與受體細胞融合時需要經過去甲基化才能維持胚胎正常發育，如果重構胚基因組DNA的甲基化模式存在異常，可引起特定基因轉錄模式發生改變，從而導致重構胚發育異常。因此，有必要尋找一種降低DNA甲基化水平，進而改善核移植效率的方法。5-氮-2′-脫氧胞嘧啶核苷（5-aza-dc）是一種DNA甲基轉移酶抑制劑，為正常胞嘧啶核苷的類似物。在細胞內這種核苷類似物可以轉化為脫氧核苷三磷酸，并在DNA復制的過程中替代正常的胞嘧啶核苷酸參與到延伸的DNA鏈中，一旦進入DNA雙鏈后，它們所含有的修飾堿基——5-氮胞嘧啶可以與DNA甲基轉移酶共價結合，使酶的活性降低，最終使處理細胞基因組DNA發生去甲基化；有研究表明DNA甲基轉移酶抑制劑5-aza-dc處理牛供體細胞，能有效降低其甲基化水平[1，2]。舒金輝[3]利用5-aza-dc（0.005～0.09 μmol/L）處理水牛成纖維細胞，顯著降低了供體細胞的甲基化水平并提高了隨后核移植的效率。延邊奶山羊耳成纖維細胞作為延邊奶山羊體細胞克隆的核供體有重要的研究意義。因此，本研究旨在探討5-aza-dc對延邊奶山羊體細胞克隆供體細胞的影響，為提高延邊奶山羊體細胞克隆效率提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

1.1.1 試劑 DMEM、EDTA、DMSO、5-aza-dc（DMSO預融，超純水配制成0.25 mg/mL的濃縮液備用）、PI、Hochest33342、MTT、Giemsa染液、胰蛋白酶及其他基礎藥類均購自SIGMA中國有限公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司，DNA提取試劑盒購自寶生物（大連）有限公司。

1.1.2 材料 延邊奶山羊耳部組織塊。剪取奶山羊（母）耳部血管較少處組織，大約1.5×2.0 cm2。用PBS沖洗1次，75%酒精浸泡30 s，再用PBS沖洗3次，最后將組織塊剪碎。經過3～5次PBS及胰蛋白酶洗滌后，均勻接種于25 cm2培養瓶中，5 h后加含15% 胎牛血清的DMEM培養液[4]。每3～5 d換液1次。當原代細胞匯合至80%時，消化傳代，3代以后的成纖維細胞可用于試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 5-aza-dc處理延邊奶山羊耳成纖維細胞 取3代以上的延邊奶山羊耳成纖維細胞，消化傳代，調整細胞密度為105個/mL，接種于24孔或96孔培養板，待細胞處于對數生長期，改用添加5-aza-dc的10%DMEM培養液分別培養。5-aza-dc的濃度設定為0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L。

1.2.2 5-aza-dc對細胞活率的影響 不同濃度（0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L）的5-aza-dc各處理成纖維細胞24、48、72、96 h后，96孔板每孔添加5 mg/mL MTT 10 μL，作用4 h 后，吸出培養液，每孔添加150 μL DMSO，振蕩10 min，酶聯反應儀測492 nm處的OD值。

1.2.3 5-aza-dc對細胞形態的影響 不同濃度（0、0.005、0.010、0.030、0.050、0.100 μmol/L）的5-aza-dc處理成纖維細胞72 h后，顯微鏡下觀察細胞形態。

1.2.4 5-aza-dc對細胞染色體的影響 不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細胞72 h后，換液，每孔添加50 μL秋水仙素，2.5～3.0 h后，消化懸浮細胞，1 000 r/min 離心10 min，37 ℃預溫的0.075 mol/L KCl低滲處理30 min后，用新鮮固定液（甲醛∶冰醋酸=18∶7，V/V）固定細胞2次，最后用0.5～1.0 mL固定液懸浮細胞，滴片，Giemsa染色，干燥后于油鏡觀察[5]。每組處理選取一定數量的清晰分裂相，記錄變異的染色體數目。

1.2.5 5-aza-dc對細胞凋亡的影響

1）Hochest33342/PI雙染法熒光顯色法檢測細胞凋亡。不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細胞72 h后，消化懸浮細胞，調整細胞密度為106個/mL，加入5 μg/mL的Hochest33342熒光染色，37 ℃避光孵育10 min，離心去上清，用培養液懸浮，加入5 μg/mL的PI染色液，4 ℃冰箱孵育15 min，熒光顯微鏡下觀察[6]。

2）瓊脂糖凝膠電泳法檢測細胞凋亡。不同濃度（同上）的5-aza-dc處理成纖維細胞72 h后，消化收集細胞于1.5 mL離心管中，5 000 r/min離心5 min，500 μL PBS懸浮細胞后，按DNA提取試劑盒步驟提取DNA，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3 數據分析

試驗所得數據使用SPSS17.0進行分析，采用單因素方差分析（One-way ANOVA）的方法處理數據。

2 結果與分析

2.1 5-aza-dc對細胞活率的影響

由表1可知，不同濃度的5-aza-dc分別培養延邊奶山羊耳成纖維細胞24、48、72、96 h后的細胞活率，比較可知72 h組效果較好，且與48 h、96 h組差異不顯著，因此后續試驗中細胞均處理72 h。

2.2 5-aza-dc對細胞形態的影響

由圖1可知，未經5-aza-dc處理的細胞生長狀態良好，接觸緊密，細胞大小均一，生長速度較快。而經過5-aza-dc處理后的細胞隨著5-aza-dc濃度的升高，細胞變得細長，生長緩慢，細胞間隙增大，形態不規則，甚至有的地方細胞大片脫壁死亡。

2.3 5-aza-dc對細胞染色體的影響

采用常規核型分析方法，分析不同濃度的5-aza-dc處理的延邊奶山羊耳成纖維細胞，每個處理組選取50個分散較好的清晰分裂相，統計畸變染色體概率。由圖2可知，當濃度≤0.010 μmol/L時，染色體畸變率對照組與其他兩組差異不顯著；當濃度≥0.030 μmol/L時染色體畸變率顯著增加，出現多倍體（圖3）。當濃度達到0.1 μmol/L時，染色體畸變率達到12%。

2.4 5-aza-dc對細胞凋亡的影響

2.4.1 Hochest33342/PI雙染法熒光顯色法檢測細胞凋亡 Hochest33342/PI雙染色后，在熒光顯微鏡下可見凋亡細胞呈強藍色、弱紅色熒光，壞死細胞呈強紅色，而正常的細胞則呈弱藍色熒光。當濃度為0、0.005、0.010 μmol/L時，凋亡細胞較少；濃度≥0.030 μmol/L時出現較多凋亡細胞；濃度為0.100 μmol/L時，細胞凋亡增加，死細胞數目也增多。如圖4所示。

2.4.2 瓊脂糖凝膠電泳法檢測細胞凋亡 由圖5可知，當濃度≤0.010 μmol/L時，細胞無拖帶現象，說明無凋亡細胞；濃度≥0.030 μmol/L時開始出現拖帶現象，說明出現凋亡細胞；濃度為0.050、0.100 μmol/L時，細胞大量凋亡，拖帶現象明顯。

3 討論

3.1 5-aza-dc對細胞活率、細胞形態的影響

5-aza-dc是一種典型的DNA甲基轉移酶抑制劑，為胞嘧啶核苷的類似物。Kumar等[7]利用0、0.5、1.0、2.0、3.0 μmol/L的5-aza-dc處理第五代豬胎兒成纖維細胞（PFF），發現不同濃度的5-aza-dc均抑制PFF的生長，較高濃度的5-aza-dc處理會導致細胞的形態和染色體的倍性發生改變。Enright等[8]對供體成纖維細胞進行5-aza-dc處理后發現高劑量5-aza-dc（0.08～0.31 μmol/L）可以降低細胞甲基化水平，其研究也發現5-aza-dc處理72 h為最佳處理時間。鑒于5-aza-dc對細胞的毒性作用，本試驗采用較低濃度的5-aza-dc（0～0.100 μmol/L）處理延邊奶山羊耳成纖維細胞。結果表明，經5-aza-dc處理后的細胞生長速度、形態等與對照組相比無明顯差異，說明延邊奶山羊耳成纖維細胞對5-aza-dc具有較強的耐受性。但是隨著處理時間的延長，細胞形態改變、死亡數增多，逐漸出現脫壁等現象，這可能是與5-aza-dc對細胞的毒性有關。這與Kumar等[7]的試驗結果一致。

3.2 5-aza-dc對細胞染色體的影響

有研究證明，供體細胞的培養環境以及藥物等處理會導致其染色體異常，進而引起隨后NT胚胎染色體異常，說明在核移植前首先檢查供體細胞的染色體還是必要的[9]。本試驗使用常規染色體核型分析方法，即經低滲、固定、Giemsa染色等步驟后，滴片制備染色體標本。結果表明，高濃度的5-aza-dc對細胞染色體有致畸作用，濃度越高染色體出現異常的幾率越大；而低濃度（≤0.010 μmol/L）對染色體影響不大。通過瓊脂糖凝膠電泳實驗進一步驗證高濃度的5-aza-dc對染色體的影響，可見明顯的拖帶現象，分析原因可能是染色體結構發生改變，如斷裂等。

3.3 5-aza-dc對細胞凋亡的影響

PI、Hochest33342均可與細胞核DNA（或RNA）結合。但是PI不能通過正常的細胞膜，Hochest33342則為膜通透性的熒光染料，故細胞在處于壞死或晚期凋亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。本研究用5-aza-dc處理延邊奶山羊耳成纖維細胞72 h后，觀察不同的濃度對細胞凋亡的影響，采用Hochest33342和PI雙染色法檢測細胞凋亡，在熒光顯微鏡下可見凋亡細胞呈強藍色、弱紅色熒光，壞死細胞呈強紅色，而正常的細胞則呈弱藍色熒光。正常細胞和中早期凋亡細胞均可被Hochest33342著色，但是正常細胞核的Hochest33342著色的形態呈圓形，淡藍色，內有較深的藍色顆粒；而凋亡細胞的核由于濃集而呈亮藍色，或核呈分葉，碎片狀。細胞凋亡最明顯的生化特征是Ca2+、Mg2+依賴的內源性核酸酶的激活，細胞核染色體從核小體間斷裂成180～200 bp的寡核苷酸片段。針對這些片段應用瓊脂糖凝膠電泳技術。凋亡細胞呈明顯的梯狀條帶。本研究通過瓊脂糖凝膠電泳結果可見，0～0.010 μmol/L幾組都沒有出現明顯的拖帶現象，而從0.030 μmol/L組就開始有拖帶現象，0.050 μmol/L 和0.100 μmol/L濃度組與對照組相比細胞發生凋亡的比例顯著增加。此結果進一步證明高濃度的5-aza-dc可以導致細胞凋亡。

5-aza-dc處理延邊奶山羊成纖維細胞適宜時間為72 h，隨著5-aza-dc處理濃度的升高，細胞形態有所改變，接觸不緊密。當濃度升高到0.100 μmol/L時大片細胞脫壁死亡；當濃度≥0.030 μmol/L時，染色體畸變率顯著增加，0.005 μmol/L和0.010 μmol/L組對染色體核型的影響與對照組相比差異不顯著；瓊脂糖凝膠電泳法檢測經5-aza-dc處理的細胞凋亡情況，結果表明高濃度的5-aza-dc可以導致細胞凋亡，低濃度的5-aza-dc對細胞凋亡的影響較小。以上說明高濃度的5-aza-dc對細胞有一定毒性作用，但是低濃度對細胞影響較小，可以應用低濃度的5-aza-dc作為DNA甲基轉移酶抑制劑處理供體成纖維細胞，嘗試建立一種既不影響成纖維細胞生物學特性，又可以降低供體細胞核的甲基化狀態的方法，從而提供一種提高體細胞核移植效率的方法。

參考文獻：

[1] 李世杰.體細胞克隆中核的重編程[J].科學通報，2004，49（8）：721-726.

[2] 馬康目.細胞核重編程對克隆的影響[J].生命科學，2008，20（3）：431-437.

[3] 舒金輝.水牛體細胞核移植與甲基化檢測的研究 [D].南寧：廣西大學，2007.

[4] 于昊贏.不同冷凍程序和冷凍保護劑對延邊奶山羊耳部成纖維細胞冷凍效果的影響 [D].吉林延吉：延邊大學，2012.

[5] 孫曉冬.延邊奶山羊耳成纖維細胞培養體系的建立 [D]. 吉林延吉：延邊大學，2012.

[6] 李鳳珍. 5-氮-2′-脫氧胞苷對牛成纖維細胞周期、染色體和凋亡的影響 [D].武漢：華中農業大學，2009.

[7] KUMAR B M，JIN H F，KIM H J，et al.DNA methylation leves in porcine fetal fibroblasts indueed by an inhibitor of methylation 5-aza-dc[J].Cell Tissue Res，2006，325（3）：445-454.

細胞生物學特性范文第2篇

[關鍵詞] 骨髓; 間充質干細胞; 兔; 細胞培養

[中圖分類號] R329.2+8 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701(2010)05-29-03

Effects of Adherence and Density Gradient Centrifugation Methods on Biological Characteristlcs of Rabbit Marrow Mesenchymal Stem Cells Cultured in Vitro

LI Ting1 SUN Jinhu1 ZHAO Liang2 LI Shuai1

1.College of Stomatology,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China;2.The people’s Hospital of Hechi City,Hechi 546300,China

[Abstract] ObjectiveTo study the effects of adherence and density gradient centrifugation(DGC) methods on biological characteristics of rabbit marrow mesenchymal stem cells cultured in vitro. MethodsRabbits aged 2 months were used to isolate marrow mesenchymal stem cells(MSCs). MSCs with adherence and DGC methods were cultured,passaged,amplified and purified in vitro. The living characteristics and adhesive rate of the primary and generations were observed respectively. The growth curve was drawn. The cell cycles and cystoskeleton were tested to study the different MSCs separated methods on the proliferation and metabolism of MSCs. ResultsMSCs were intact and fibroblast cell-shaped. Adhering spindle-shaped cells with higher cytoactive were observed in the adherence and DGC separation groups. The MSCs of primary culture in the adherence group showed more rapid proliferation,earlier colony confluence and shorter time for passage compared with DGC separation group. ConclusionThe MSCs separated by adherence showed a rapid proliferation,earlier colony confluence and shorter time for the first passage.

[Key words]Marrow; Mesenchymal stem cells; Rabbit; Cell culture

骨髓基質中存在骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs),其具有向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞等多向分化潛能,是組織工程學技術的重要的種子細胞[1]。目前,國內外已分離培養出骨髓間充質干細胞(MSC),但尚無統一的分離培養方案。雖然有多種MSCs的分離方法,但密度梯度離心法和貼壁分離法是目前骨髓間充質干細胞最常用的分離培養方法。本實驗應用密度梯度離心分離法與貼壁分離法對骨髓間充質干細胞進行分離培養,并比較分析這兩種分離法對MSC生物學特性的影響,為選擇對MSCs損傷小、易于貼壁生長和操作簡單的MSCs分離方法提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM/F-12培養基(Gibco,USA),胰蛋白酶(Gibco,USA),EDTA(sigma,USA),胎牛血清(Gibco,USA),其他均為國產分析純試劑。碘化丙啶、噻唑藍和二甲基亞砜均為SIGMA產品,Percoll為Pharmacia公司產品。實驗動物日本大耳白兔12只,體重2kg左右,雌雄隨機,動物飼養條件為25℃,濕度60%~ 70%。

1.2 方法

1.2.1 骨髓細胞的制備 用3%戊巴比妥鈉將兔全身麻醉,用脫毛劑脫去兔后下肢的毛發,用3%的碘酊和75%酒精徹底消毒兔后下肢后移入工作臺,鋪無菌巾,解剖出脛骨上、下端,用骨鉆分別在脛骨上端和下端打孔,暴露骨髓腔。用7號針頭刺入兩側骨端的骨孔內,用加有肝素的DMEM 培養基反復沖洗骨髓腔,收集骨髓細胞懸浮液備用。

1.2.2 離心分離法制備MSCs 將骨髓細胞懸浮液貼壁加入到預置等體積1.077g/L的Percoll淋巴細胞分離液的離心管中,2000r/min離心20min。吸取中間乳白色的界面層,與5倍體積的生理鹽水混勻后1000r/min離心5min,除去殘留的Percoll成分。用磷酸鹽緩沖液洗滌1次,然后均采用F12-DMEM 培養液(含體積分數為0.1的進口胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L鏈霉素)重懸細胞,按1×105的密度接種于25mL培養瓶中,37℃、0.05%的CO2飽和濕度下培養,3d后首次更換培養液,棄去未貼壁細胞,此后2~3d換液1次。

1.2.3 貼壁分離法制備MSCs 將骨髓沖洗液放入平皿,再抽出平皿中液體對髓腔進行二、三次沖洗。用吸管反復吹打呈單細胞懸液,每個脛骨的骨髓單細胞懸液經接種入一個25mL培養瓶中,于37℃ 、體積分數為0.05的CO2孵箱飽和濕度培養,5d后首次更換培養液,棄去未貼壁細胞,此后每三四天換液1次。

1.3 細胞計數、細胞形態學觀察

在倒置顯微鏡下,每天觀察貼壁分離培養、密度梯度離心培養條件下的原代及傳代細胞的生長情況和活體形態特征。MSCs活力測定取1～3代傳代細胞,制成單細胞懸液,以0.4% 臺盼藍作為染色劑,用細胞計數板計數活細胞和死細胞,共3次,取3次平均值,計算細胞活力:活細胞率(%)=活細胞數/(總細胞數-著色細胞數)×100。骨髓間充質干細胞按2×104/孔接種于24孔培養板中。分別于接種后第2,3,4,5,6,7天收集4個復孔細胞(注:原代培養細胞于接種后4d換液時開始,即4,5,6,7,8,9, 10,11,12,13,14,15,16),用酚酞藍拒染法計數活細胞。根據計數結果繪制生長曲線。取MSCs按2×104個細胞/孔接種于24孔培養板內,從接種后第2天起,每日隨機收集4個復孔細胞用計數,取均數描記生長曲線。

1.4 MSCs傳代培養

原代細胞長滿單層后,即可進行傳代,首先棄去培養液,用CMF-PBS液洗細胞兩次后,加入消化液(0.25%胰蛋白酶+0.01% EDTA)約1mL,消化約5min,倒置顯微鏡下證實細胞已完全分離(此時鏡下可見細胞呈圓球形),加入4mL含血清培養基,反復輕輕吹打成單細胞懸液,離心并用無血清培養基洗滌1次后重新加入含血清培養基計數,按所需密度傳代培養或冷藏。

1.5 MSCs細胞的HE、Gimas染色及細胞骨架制備

Gimas及HE染色采用文獻報道方法,細胞骨架制備按參考文獻[2]方法。

1.6 MSCs流式細胞儀觀察制樣

按文獻[2]的方法制備觀察樣本,用流式細胞光度計(FCM)檢測,采用激發波長為488nm的氬離子激光,DNA被PI著色成紅色熒光,蛋白質被FITC著色成綠色熒光,打印出各組細胞周期所占百分比,計算增殖指數(proliferation index,PIX)衡量細胞的增殖活性,PIX=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%。兩組檢測數據用均數±標準差(χ±s)表示,各項指標差異顯著性用t 檢驗。

2 結果

2.1 細胞形態學觀察

2.1.1 密度梯度離心法 細胞培養24h后,均可見大圓形細胞與少量小圓形細胞懸浮于培養液中,4d首次換液后可見少量細胞呈短梭形、多角形細胞及三角形,培養到12~14d細胞增殖鋪滿至80%左右,15~16d細胞增殖逐漸匯合成單層細胞。傳代后至第3代時細胞形態較均勻,呈長梭形集落狀分布。

2.1.2 貼壁分離法 細胞培養24h后,均可見數目較多的小圓形細胞、血細胞懸浮于培養液中。4d時首次換液后可見到梭形、多角形細胞及三角形的貼壁細胞;第7~ 8天可見這些細胞呈集落樣分布;至第10~12天細胞增殖鋪滿至80%左右,14~15d時增殖逐漸匯合成單層細胞。Gimas 染色可見細胞核為紫紅色,圓形或橢圓形,鏡下可見分裂相細胞,兩種分離方法未見不同。(圖1)

2.2 細胞活性檢測

密度梯度離心法:活細胞率為96.2%,貼壁分離法:活細胞率為98.7%,組間比較差異無顯著性(P>0.05)。

2.3 細胞生長曲線

見圖4,應用密度梯度離心法與貼壁分離法第1代細胞生長曲線測定結果是密度梯度離心法的MSCs生長期比貼壁分離法MSCs的生長曲線延遲1~2d。第2、3代細胞生長曲線測定結果,細胞生長曲線基本相似,在培養1d時,細胞量稍有減少;第2天開始至第6天,細胞呈指數生長,細胞數迅速增長,7d進入平臺期,此后細胞數目無顯著改變,細胞增殖減慢(圖2)。

2.4 培養MSCs細胞骨架觀察

鏡下可見細胞骨架主要結構形式為環形排列,貫以輻射狀微管組成圓形蜘蛛網形,細胞間有角形的突起。隨著細胞傳代次數的增大,細胞骨架逐漸過渡到以梭形細胞骨架為主要形式(圖3)。

2.5 培養MSCs的細胞周期

第3代MSCs培養72h后,經PI和FITC雙染在流式細胞儀下觀察分析可見細胞增殖活躍,細胞蛋白質含量較豐富。貼壁法MSC:G1期細胞為67.5%,G2期細胞為28.9%,S期細胞為3.6%,細胞增殖指數為(PIX)32.5%,離心法MSC:G1期細胞為68.2%,G2期細胞為28.1%,S期細胞為3.7%,細胞增殖指數為(PIX)31.8%,經統計學分析貼壁法和離心法MSC的PIX差別無意義(表1)。

3 討論

骨髓間充質干細胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)是具有不斷增殖和自我更新能力的成體干細胞之一,在適當的條件下,可分化為成骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、脂肪細胞[3-7]。獲得大量高純度的MSCs是將MSCs用于研究或臨床治療的基礎,目前用于分離MSCs的方法主要有貼壁分離法、密度梯度離心法、流式細胞儀分離法和免疫磁珠分離法。其中后兩者由于所需儀器昂貴、對MSCs損傷較大加之骨髓間充質干細胞尚未發現其特有的表面標志,故較少應用[3]。目前常用方法仍為貼壁法和密度梯度離心法。

本實驗采用貼壁法分離培養小鼠骨髓間充質干細胞,隨著細胞傳代,去除其它可貼壁的雜質細胞,傳過三代后細胞形態趨向一致,獲得較為純化的梭形成纖維樣細胞(MSCs)。應用密度梯度離心法在原代培養獲得的細胞,仍需用貼壁法進一步純化,并且其操作步驟復雜,離心過程中不可避免地造成細胞損失或損傷,同時發現其原代培養時細胞的活性和生長曲線都遲于貼壁法分離的MSCs,而且MSCs貼壁所需的時間較貼壁分離法長,這可能與離心過程中丟失了骨髓微環境中對骨髓間充質干細胞生長有利的細胞因子和促貼附物質有關。原代培養中可見離心法的MSCs純度較貼壁法的MSCs大,但隨著細胞的傳代,兩者之間的差別逐漸消失。本實驗發現應用離心分離法與貼壁分離法經過傳代都可獲得活性好、形態均一的骨髓間充質干細胞,但在實驗過程中要避免軟組織的細胞污染沖洗出的骨髓細胞,對所用試劑盡量做到現用現配。同時應用離心分離法時應注意時間不能過長,離心力不能過大,盡量減少細胞的損傷。本研究揭示雖然密度梯度離心法理論上可在原代獲得較純化的細胞,但仍需用貼壁法進一步純化,而且容易發生細胞污染和損傷等,因此其并不具有明顯優勢,相反貼壁分離法具有方法簡單、細胞損傷小等優點。

總之,本實驗應用的兩種方法均可獲得可靠的MSCs。對原代培養的MSCs,貼壁分離法具有對MSCs損傷小、易于貼壁生長和操作簡單等優點,但其MSCs純度較離心分離法稍低。經過多次傳代后采用兩種方法所獲得的MSCs的生物學特性已無區別,均可獲得具有良好的活性的MSCs。

[參考文獻]

[1] Pittenger MF,MackayAM,Beck SC,et al. Multilineage potential ofhuman mesenchymal stem cell[J]. Science,1999,284(5411):143-147.

[2] 孫晉虎,石冰,王大章. A系小鼠胚腭突細胞培養及生物學特性的研究[J]. 華西口腔醫學雜志,2002,20(6):441.

[3]邱麗燕,王金福. 骨髓間充質干細胞的研究進展[J]. 生物工程學報, 2003,19(2):136.

[4] Orlic D,Kajstura J,Chiment S,et al. Bone marrow cells regenerate in- fracted myocardium[J]. Nature,2001,410(6829):701.

[5] Wagner W,Wein F,Seckinger A,et al. Comparative characteristics of mesenehymal stem cells from human bone marrow,adipose tissue,and umbilical cord blood[J]. Exp Hematol,2005,33(11):1402-1416.

[6] Ringe J,Kaps C,Schmitt B,et al. Porcine mesenchymal stem cells induction of distinct mesenchymal cell lineages[J]. Cell Tissue Res,2002, 307(3):321.

細胞生物學特性范文第3篇

關鍵詞: 成纖維細胞;細胞培養

摘 要:目的 探討來自正常皮膚、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩組織的成纖維細胞的生物學特性. 方法 對三種組織均采用組織塊法進行細胞的原代培養，采用胰蛋白酶消化傳代，分別利用繪制細胞生長曲線，3 H-胸腺嘧啶摻入及3 H-脯氨酸摻入等方法觀察細胞的增殖，DNA合成代謝及膠原合成等情況，并比較它們之間的差異. 結果 瘢痕疙瘩成纖維細胞在細胞增殖、DNA合成代謝及膠原合成量等方面均明顯高于正常皮膚及增生性瘢痕組織來源的成纖維細胞，后兩者之間有一定區別但無統計學意義. 結論 不同組織來源的成纖維細胞其生物學行為亦有所區別，因此在進行實驗研究時應有一定的針對性.

Keywords:fibroblasts;cell culture

Abstract:AIM To investigate the biological characteristics of fibroblasts derived from normal human dermal，hyper-trophic scar and keloid tissues.METHODS Fibroblasts pri-mary culture was carried out by the assay of planting tiny tis-sue masses into culture bottles.The fibroblasts，after being isolated from different tissues，were cultivated and the cell growth curves were drawn.Meanwhile，3 H-TdR and3 H-pro-line incorporations were employed to measure the DNA metabolism and collagen synthesis of the cells respectively.RESULTS Keloid fibroblasts had a much more active bio-logical characteristic than that of the other two kinds of　fibroblasts.There was a slight difference between the normal dermal fibroblasts and hypertrophic scar ones.CONCLUSION Fibroblasts derived from different tissues have their own biological characteristics.This makes it necessary for us to do the research on different tissues with different fibrob-lasts.

0 引言

增生性瘢痕和瘢痕疙瘩常見于燒傷或皮膚外傷愈后，是機體組織異常修復的結果.在臨床上輕者可影響美觀，重者可導致鄰近器官的功能障礙甚至畸形，這些均直接影響患者的生活質量［1］ .研究證實，增生性瘢痕和瘢痕疙瘩的形成主要是由于組織在修復過程中成纖維細胞的活動異常增強，從而產生大量的Ⅰ型膠原、蛋白聚糖及纖維粘連蛋白等基質成分并使之沉積所致［2，3］ .對于這種疾病目前臨床上尚缺乏有效的治療手段，實驗研究則由于缺乏理想的動物模型而受到很大的限制，因此我們通過該實驗初步探討不同組織來源的成纖維細胞的生物學區別.

1 材料和方法

1.1 材料 DMEM培養基、胰蛋白酶及胃蛋白酶均購自Gibco公司，小牛血清購自杭州四季青公司，3 H-TdR及3 H-脯氨酸購自中科院原子能物理研究所，MTT購自華美生物工程公司.

1.2 方法 正常皮膚、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩組織均來自外科手術后所切除標本，所培養出的成纖維細胞分別命名為正常皮膚成纖維細胞（normal skin fi-broblast，NsFb）、增生性瘢痕成纖維細胞（hyper-trophic scar fibroblast，HTsFb）及瘢痕疙瘩成纖維細胞（keloid fibroblast，KFb）.標本剪去表皮及皮下組織，在小瓶中剪成碎組織塊（0.5mm×0.5mm×0.5mm），接種于25mL培養瓶中，37.0℃，50mL L-1 CO2 孵箱中孵育4～6h后加入含100mL L-1 小牛血清的DMEM培養基，繼續培養，2～3d換液1次，待細胞長出后即為原代成纖維細胞.當原代成纖維細胞達到80%～90%融合時，用2.5g L-1 胰蛋白酶消化收集細胞，用含10mL L-1 小牛血清的DMEM重懸細胞，按1 3傳代，實驗用第3～6代. 1.3 觀測指標 ①細胞增殖.計數法:將三種細胞取相同代數并于其對數生長期時同時消化并制備單細胞懸液，調整細胞濃度為5×106 L-1 ，將細胞按1mL/孔接種48孔培養板，每種細胞設1個復孔，共設12組.置孵箱培養24h后以2.5g L-1 胰蛋白酶消化第一組細胞并以胎盼藍做活細胞染色，在鏡下計數，此后每日于相同時間點連續測量12d，依所得數據繪制細胞數-時間的細胞生長曲線.四唑鹽（MTT）比色法:同上法接種細胞并于24h后將第一組細胞每孔加入80μL MTT（20g L-1 ），繼續孵育4h后棄去上清，再每孔加入0.5mL二甲基亞砜，振蕩30min后選擇490nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定個孔的吸光度，此后每日于相同時間點連續測量12d并繪制吸光度值-時間的細胞生長曲線.②細胞DNA合成的測定.胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的堿基，為DNA合成所必需，因此用同位素3 H標記TdR即3 H-TdR作為DNA合成的前體能摻入其合成代謝過程，通過檢測細胞放射性強度可以反映出細胞DNA的代謝情況.接種細胞于48孔板，每種細胞設8個復孔，每孔細胞數為1×104 ，于接種后24h換液并每孔加入1μci3 H-TdR，繼續培養12h后棄培養基，用37℃PBS緩沖液沖洗培養板10次，風干后每孔加入2mol L-1 NaOH200μL，室溫放置30min，鏡下觀察細胞完全溶解后將各孔溶液分別收集于纖維濾紙上，于Beckman LS-6500型液閃計數儀上測定cpm值.③細胞膠原合成的測定.脯氨酸是成纖維細胞合成膠原所必需的氨基酸之一，因此3 H-脯氨酸作為膠原合成的前體能摻入其合成代謝過程.同上法接種細胞于48孔板，于接種后12h換液，繼續孵育24h后進行3 H-脯氨酸摻入:配制β-氨基丙腈，L-維生素C，3 H-脯氨酸混合液，終濃度分別為100g L-1 ，50g L-1 ，10ci L-1 ，按每孔100μL進行摻入，孵育24h后收集并進行cpm值測定.統計學處理:數據以x ±s表示，應用Origin軟件進行組間t檢驗.

2 結果

2.1 原代成纖維細胞的生長 結果表明，KFb游出組織塊的速度明顯快于NsFb及HTsFb（P

圖1 －圖3 略

2.2 細胞的增殖 細胞記數法與MTT比色法均顯示，KFb的生長增殖明顯較NsFb與HTsFb快，表現為進入對數生長期的時間短而持續時間長且沒有明顯的平臺期;HTsFb的增殖較NsFb略慢，但基本趨勢一致，無明顯區別（Fig4）.

2.3 細胞的DNA代謝及膠原合成 結果表明，KFb的DNA合成量及膠原合成量均明顯高于NsFb與HTsFb（P

3 討論

燒傷及皮膚損傷是臨床上較常見的病種，其損傷后的愈合過程是一系列修復細胞如表皮細胞、成纖維細胞及內皮細胞等與細胞外基質及多種細胞生長因子共同作用的結果，其中成纖維細胞的生物學活動構成了創面愈合與瘢痕形成的主要病理學基礎，因此目 前國內外在研究增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的形成機制時主要將目光集中于成纖維細胞生物學行為及其相關因素的研究方面［4-6］ .

從皮膚組織中獲取成纖維細胞的方法有消化法和組織塊法兩種，消化法又分為胰酶消化法及膠原酶消化法，由于消化法易受組織塊的來源、大小、酶作用的時間和溫度等多方面因素的影響［7］ ，因此在本實驗中對三種組織我們均采用組織塊法進行細胞的原代培養.人體成纖維細胞在體外培養情況下一般能存活一年左右，能繼續培養50代，用于實驗時國外學者多采用3～10代［8，9］ 處于對數生長期的細胞.

我們首先通過組織塊培養法對正常皮膚、增生性瘢痕及瘢痕疙瘩中的成纖維細胞進行了原代培養研究，發現它們在細胞游出及生長方面均存在著一定的差異，其中瘢痕疙瘩成纖維細胞表現最為活躍.其次在細胞的繼代培養研究中，我們通過比較它們在生長增殖、DNA代謝及膠原合成等方面的區別，進一步證實瘢痕疙瘩成纖維細胞的生物學功能遠較其他兩種成纖維細胞活躍，這與臨床上這三者的區別是一致的.來自增生性瘢痕的成纖維細胞與正常皮膚成纖維細胞之間雖有一定區別但差異不明顯，這可能是臨床上增生性瘢痕在晚期發生退化的原因之一.

綜上所述，我們的研究在一定程度上揭示了不同組織來源的成纖維細胞在生物學特性上的差異，同時說明在進行相應研究時應有一定的針對性.

參考文獻

［1］Chen B，Jia CY，Su YJ，Xu MD，Hu DH，Zhu XX.Better life quality:Large sheet thin and/or split-thickness skin autograft-ing in the treatment of extensive third degree burn victims ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（5）:420-422.

［2］Murray JC，Pollack SV，Pinnell SR.Keloids:A review ［J］.J Am Acad Dermatol，1981;4（3）:461-468.

［3］Robert F，Diegelmann.Cell culture and biochemical aspects of normal and abnormal wound healing:An overview ［J］.J Urol，1997;157（2）:298-302.

［4］Colige AC，Lambert CA，Nusgens BV.Effect of cell-cell and cell-matrix interactions on the response of fibroblasts to EGF in vitro ［J］.Biochem J，1992;285（3）:215-221.

［5］Han JT，Liu SJ，Chen B.Effects of suramin on proliferation of keloid fibroblasts in vitro ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（5）:451-452.

［6］Zhang LX，Guo SZ，Wang Z.Biological effects of supernatant from melanocytes culture on proliferation of hypertrophic scar fi-broblasts ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med U-niv），1999;20（2）:166-167.

［7］Dong ML，Chen B，Xu MD，Su YJ，Tang CW.PDGF-AB ef-fects on proliferation of hypertrophic scar fibroblasts ［J］.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），1999;20（5）:437-438.

細胞生物學特性范文第4篇

【關鍵詞】 骨髓基質細胞;細胞培養;表面抗原

DOI：10.14163/ki.11-5547/r.2015.03.005

In vitro culture ofmarrow stroma cell and its biological characteristics WANG Xiang-yi， LI Ji-shen， LIU Fu-quan， et al. Department of Neurosurgery， The Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University， Baotou 014010， China

【Abstract】 Objective To explore in vitro culture method of human bone mesenchymal stem cells （BMSCs） of cerebral hemorrhage sequelae patients and its amplified biological characteristics. Methods Ilium myeloid tissues were taken from patients with 3-month cerebral hemorrhage sequelae， and they were in adherence standing culture after removing the lymphocyte， and multiple liquid purification. Morphology and growth characteristics were examined by inverted phase contrast microscope. Cell surface markers CD29， CD34， CD45， and CD105 in the third and sixth generation were tested by flow cytometer. Results After 48 h of phase contrast microscopy inoculate， there were several spindle-shaped cells. After 6～8 d， cells were in colony. After passage， cellular morphology tended to be conform and swirling. Flow cytometer showed that CD34 and CD45 were positive， while CD29 and CD105 were negative. Conclusion In vitro density gradient centrifugation and adherence standing method can provide a large number of homogeneous BMSCs.

【Key words】 Marrow stroma cell; Cell culture; Surface antigen

細胞移植開辟了一條治療腦損傷后遺癥的途徑， 目前發現BMSCs植入后會改變損傷區的局部環境， 通過自分泌和旁分泌神經營養因子來保證自身的存活和促發內源修復[1]。骨髓基質細胞是成體干細胞，與其他的干細胞相比有顯著的優越性，是細胞移植治療中樞神經系統疾病的種子細胞之一。由于骨髓中細胞成分比較混雜， BMSCs在骨髓中含量極少， 僅占骨髓中有核細胞的 0.001%～0.01%， 實際應用中需對其進行體外分離純化并大量擴增[2]。本實驗對人BMSCs進行體外分離培養， 并對培養細胞的表面抗原進行測定， 為臨床應用提供足量有活性的骨髓基質細胞。現報告如下。

1 材料與方法

1. 1 主要試劑與設備 淋巴細胞分離液Ficoll-Hypaque （1.077 g/ml， 上海試劑二廠）， DMEM/F12培養基 （Gibco）， 胰蛋白酶（Gibco）， 胎牛血清（Hyclone）， 異硫氰酸熒光素標記的鼠抗人CD29、CD34、CD45、CD105（Immunotech）， Caliber 流式細胞儀（BD公司）、倒置相差顯微鏡（Nikon）、CO2恒溫培養箱（Heraeus）， 低速離心機（北京醫用離心機廠）。

1. 2 方法

1. 2. 1 BMSCs獲得和培養 骨髓來源：病例1， 54歲， 男， 高血壓腦出血患者， 行髂骨嵴骨髓穿刺獲得， 無菌抽取， 肝素抗凝的骨髓中加入等體積的無鈣鎂磷酸緩沖液， Ficoll分離， 取單個核細胞層， 用無鈣鎂磷酸緩沖液洗滌2次， DMEM/F12培養基洗滌1次， 以1×106/ml的細胞密度接種， 用含10% FBS DMEM/F12培養基在37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養， 第1次72 h后更換新鮮培養基， 去除未貼壁細胞并繼續培養， 后每3～4天換液1次， 以去除未貼壁細胞。連續培養2周后， 當基質細胞貼壁約80%時， 按照1：2比例傳代。通過傳代， 對BMSCs進行純化和擴增， 取第3、6代的細胞用于流式檢測。體外培養的BMSCs采用倒置相差顯微鏡， 逐日觀察細胞生長情況和形態特征。

1. 2. 2 BMSCs表面抗原檢測 采用直接免疫熒光染色流式細胞術， 測定BMSCs表面抗原 CD29、CD34、CD45、CD105。

2 結果

2. 1 體外培養 BMSCs形態學觀察 倒置相差顯微鏡下， 剛接種的骨髓懸液中含有大量懸浮細胞， 無細胞貼壁;48 h后， 發現少數細胞貼壁， 呈梭形。72 h后換液， 將未貼壁細胞棄去。貼壁細胞呈克隆性生長， 細胞增殖后形態多樣， 呈異質性， 以長梭形細胞為主， 亦可見三角形、多角形及扁圓形細胞。6～8 d后細胞形成集落。傳代后， 細胞形態趨于一致， 呈長梭形， 細胞排列緊密， 可成漩渦狀。見圖1。細胞傳至第12代時， 胞漿內顆粒物增多， 細胞折光性變差， 提示細胞活力變弱， 增殖能力減弱。

2. 2 BMSCs細胞表面抗原檢測結果 流式細胞儀分析 BMSCs表面抗原， 流式細胞儀檢測顯示CD34、CD45陰性為非造血細胞， 且表達率在3代時（2.52%、2.07%）%較6代時（0.32%、0.14%）高， 說明第6代幾乎為純基質細胞。而CD29、CD105陽性說明BMSCs較為幼稚， 且3代和6代數值無差異。

3 討論

研究已明確BMSCs是成體干細胞的一種， 但細胞成分不單一， 有可能包含不同分化階段的前體細胞的混合物[2， 3]。BMSCs也具有自我更新能力及多向分化潛能， 在體外經誘導可以分化為骨、軟骨、脂肪組織、神經組織及肝組織等。由于骨髓來源豐富， 取材方便， 創傷小， 在組織再生和損傷修復中有很好的臨床應用前景[1]。

BMSCs廣泛存在于胎兒和成人的各種組織和臟器中， 骨髓組織中含量最為豐富， 為了獲取種子細胞， 目前用于分離骨髓BMSCs的方法主要有：密度梯度離心法;流式細胞儀分選法;貼壁培養法;免疫磁珠分選法。作者用密度梯度分離聯合貼壁培養法進行了BMSCs的分離和培養， 其操作簡單， 經多次傳代可獲得足夠量的細胞。流式細胞儀檢測顯示CD34、CD45均陰性， 傳3代時表達率分別為2.52%和2.07%， 較6代時0.32%和0.14%高， 說明第6代幾乎為純基質細胞。

研究表明BMSCs的表面標志尚無特異性表面標志表達， 部分與間質細胞、內皮細胞和表皮細胞的表面標志有關[4-6]。主要包括：①粘附分子， 如CD44等。②生長因子和細胞因子受體， 如IL受體3、4、6、7， 干擾素γ受體等。③整合素家族成員， 包括CD49a、CD49b、CD49c及CD29、CD104等。④如CD90、CD105等。實驗選用的標記物也符合鑒定BMSCs通用標志物， 因此， 本實驗培養細胞符合BMSCs的免疫表型。

BMSCs具有多向分化潛能， 在細胞移植和基因治療方面有重要優勢。本實驗成功對BMSCs 進行分離、純化及培養， 為深入研究 BMSCs 的組織再生和修復提供了實驗基礎。

參考文獻

[1] Vaquero J， Zurita M. Functional recovery after severe CNS trauma： current perspectives for cell therapy with bone marrow stromal cells. Prog Neurobiol， 2011， 93（3）：341-349.

[2] 閆冬梅，徐開林，杜冰，等.人骨髓基質細胞的培養及鑒定.臨床血液學雜志， 2009， 22（3）：144-146.

[3] 胡學昱，羅卓荊，田爽，等.成人骨髓基質細胞體外誘導成神經細胞實驗研究.中華神經外科疾病研究雜志， 2006， 5（2）： 139-142.

[4] 謝謙， 羅莉.成人正常骨髓基質細胞體外培養及生物學特性.口腔醫學研究， 2004， 20（2）：153-155.

[5] 戚曉淵，孫澤林，劉方軍.單克隆永生化人骨髓基質干細胞分化能力和VEGF分泌量的相關性. 中華醫學雜志， 2011，91（17）： 1193-1196.

細胞生物學特性范文第5篇

原癌基因和抑癌基因所編碼的蛋白存在于細胞的各個組成部分中，包括細胞核、細胞質、線粒體和細胞膜。通過對原癌和抑癌基因蛋白結構和功能的分析，發現許多原癌基因和抑癌基因位于信號通路中的不同部位，參與許多重要的細胞活動過程，如細胞生長和分化、DNA復制和損傷修復、基因轉錄和表達、細胞周期調控等，在細胞凋亡、衰老過程中起重要作用，也在腫瘤的發生發展和轉移中扮演重要角色。Livin蛋白是新近發現的凋亡蛋白抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族的新成員之一，具有抗細胞凋亡作用，并明顯地在腫瘤組織異性表達。目前的研究表明， Livin基因在各系統的正常組織中很少表達，但在胚胎組織或發育組織、淋巴細胞性白血病、胃癌、膀胱癌、乳腺癌和黑色素瘤等多種組織中廣泛表達。非小細胞肺癌（nonsmallcell lung cancer，NSCLC）的腫瘤細胞系中也有Livin基因的表達，但其與腫瘤的發生、轉移、耐藥性等之間的確切關系尚不清楚。Livin基因特異性地表達于腫瘤組織，有可能成為NSCLC早期診斷的分子標志物，并為基因治療提供新靶點［1-3］。本文就Livin基因在NSCLC中的表達及其抗細胞凋亡作用、信號傳導途徑與調節機制等分子生物學特性作一綜述。

1 Livin基因及蛋白結構功能的多樣性

IAP是一類重要的抗細胞凋亡因子，其共同的結構特征是N端含有一個或多個(最多為3個)串聯的桿狀病毒IAP重復序列結構域(baculovirus IAP repeats domain，BIRs)和C端含有一個環指結構域(RING finger domain，RING)。目前已發現人類IAP家族有8個成員，即NIAP，XIAP(ILP1/MIHA)，cIAP1(HIAP2/MIHB)，cIAP2(HIAP1/MIHC)，survivin(TIAP)，apollon(Bruce)，ILP2(TsIAP) 和livin(MLIAP/KIAP)［2］。

Livin蛋白是IAP家族的一個新成員，一些實驗室采用IAP同源序列(BIR或RING)尋找的方法，分別從人類基因組cDNA文庫中克隆得到Livin核苷酸序列，從不同的組織中發現了Livin基因的表達。Kasof等［3］在發育組織和腫瘤組織中發現并命名了Livin基因。Lin等［4］從人胎腎cDNA文庫中分離到該基因，故稱其為KIAP（kidney inhibitor of apoptosis protein，KIAP）。Vucic等［5］發現Livin基因在G361 和 SKMel29兩種黑色素瘤細胞源株中高表達，將其命名為MLIAP（melanoma inhibitor of apoptosis protein）。Ashhab等［6］發現了該基因存在2個剪接變異體（isoforms），分別命名為Livin α和Livin β。 同時，Lin等［4］用熒光原位雜交方法確定Livin基因位于人20號染色體20q13.3區域，全長4.6 kb，包含7個外顯子。此外還發現存在長約2.2，2.8和4.0 kb的轉錄子，Livin蛋白N端僅包含一個BIR結構，包含4個α螺旋和一個三股抗平行 β片層，與相應的氨基酸殘基共同構成疏水核心。C端含有一個RING環指結構［4，6］，氨基酸殘基C124，C127，H44及C151與鋅原子結合，借以穩定整個重疊結構。

Livin蛋白有α和β兩種變異體，分別由298和280個氨基酸組成，二者相差18個氨基酸，此區域由介于BIR和RING結構之間的第6外顯子5′端54 bp的基因序列編碼。Livin蛋白主要表達于胞質，但Kasof等［3］認為livin蛋白的細胞內分布與Survivin蛋白相似，Livin蛋白既在胞質內呈絲狀表達，同時也表達于胞核，并認為livin蛋白 C末端的RING結構對介導其在亞細胞水平上的分布具有重要作用。Livin基因mRNA 3′端非翻譯區多腺苷酸化與存在未剪接加工成熟的前體RNA有關，不同的剪輯有不同的變異體及亞型，這種結構基礎有可能解釋Livin基因蛋白存在多個結構功能。如BIR結構域內單個氨基酸的突變就能發揮其抗凋亡作用，作者的實驗也發現在A549細胞中表達的Livin 蛋白缺少66個核苷酸的變異體，其確切的功能意義尚不清楚。但Livin基因蛋白結構的變化與其功能的多樣性存在明顯的相關性。

2 Livin基因在NSCLC中的表達

Livin基因僅在少數正常組織中表達，各家報道的研究結果存在較大差異，目前還不能確定Livin基因在人正常組織中的表達譜及其生理意義［2，7］。Tanabe等［7］采用 RTPCR法對15例正常肺組織和38例NSCLC組織作對比研究，發現Livin mRNA在NSCLC組織陽性率為73.6%，正常肺組織陽性率為6.7%，顯示Livin基因在NSCLC中呈高表達，同時證明Livin基因與Survivin基因在NSCLC中的表達并不相關。CrnkovicMertens 等［1，8］同時采用NSCLC組織和NSCLC源 HeLa細胞株培養檢測Livin基因及其兩種異構體Livin α和Livin β的表達，結果顯示Livin α和Livin β在NSCLC中呈高表達。采用RNAi技術分別使異構體基因沉默，發現Livin β和Livin α基因的功能意義不完全相同， Livin β在細胞凋亡中起關鍵作用。國內崔肅等［9］采用RTPCR法檢測NSCLC組織中Livin α mRNA和Livin β mRNA的表達，并用Western blot方法分析Livin蛋白的表達，結果顯示45例NSCLC組織中Livin mRNA表達陽性率為71.1％，兩種異構體基本同時表達，Livin β mRNA的表達量略高于Livin α mRNA。而在癌旁正常肺組織和肺良性瘤樣病變組織呈低表達，陽性率分別為5.7％和6.7％。而且Livin mRNA表達陽性標本中均能檢測到Livin蛋白表達。陳淼等［10］采用免疫組織化學(SABC)的方法檢測Livin蛋白在40例NSCLC組織以及12例正常和肺良性疾病組織中的表達，結果顯示22例腺癌和18例鱗癌組織中的Livin蛋白陽性率分別為45.5﹪和50.0﹪，而正常肺組織和肺良性疾病組織均未檢出Livin蛋白表達。他們同時觀察到不同分化程度NSCLC組織之間Livin蛋白的表達無顯著性差異。有和無淋巴結轉移的肺癌組織中Livin蛋白表達的陽性率分別為72.7﹪和11.1﹪，兩組的顯著性差異標志著不同的生物學特性。孫建國等［11］ 的研究結果顯示，48例NSCLC組織中Livin mRNA表達陽性率為22.9%，其表達與NSCLC組織學類型相關，腺癌中Livin mRNA表達陽性率達45.5%，明顯高于鱗癌和大細胞癌，而癌旁組織和肺良性疾病組織均未檢出陽性結果，而且Livin 蛋白表達與mRNA表達相一致。研究還發現放、化療后NSCLC組織中的Livin表達的陽性率為43.5%，顯著高于未放、化療組織，提示放、化療可明顯誘導Livin蛋白的表達，這可能與臨床上NSCLC對化療藥物和放療耐受有關。

目前，Livin基因在NSCLC組織異性地高表達的現象已引起許多學者的關注［12］，但Livin mRNA的表達與NSCLC患者的病理分型、腫瘤分化程度、淋巴結轉移及TNM分期等的相關關系尚未完全闡明，Livin基因作為NSCLC的分子標志物，成為診斷和治療NSCLC新靶點的可能性已引起人們的極大興趣。

3 Livin抗細胞凋亡作用及其調節機制

Kasof等［3，8］研究顯示，Livin蛋白N端的羧基與Caspase3，7，9的直接結合，阻斷了caspase發揮凋亡作用的途徑，從而抑制了細胞凋亡的發生。將Livin基因轉染HeLa細胞，受轉染細胞內由FADD（Fasassociated protein with death domain），Bax，RIP，RIP3及DR6誘導的細胞凋亡可被有效阻斷。Vucic等［13］將Livin基因轉染乳腺癌MCF7細胞，證實轉染細胞對Fas，TNFR1（tumor necrosis factor receptor 1），DR4（death receptor 4）及DR5介導的細胞凋亡具有顯著的抑制作用。許多化療藥物可導致腫瘤細胞DNA的損傷而誘導細胞凋亡，轉染Livin基因的MCF7細胞可有效對抗阿霉素以及4TBP（4 tertiary butylphenol）誘導的細胞凋亡。但是各家報道Livin α和Livin β蛋白的抗細胞凋亡作用存在一定差異。Yang等［14，15］觀察在Jurkat T淋巴細胞株中，Livin基因可明顯抑制由TNFα及抗CD95抗體誘導的細胞凋亡，其抗細胞凋亡作用強于Bcl 2。Livin α對STS誘導的Jurkat細胞凋亡表現出一定的抑制作用，而Livin β則無此作用。CrnkovicMertens 等［8］ 采用RNA干擾技術分別使內源性Livin α和Livin β基因沉默，檢測兩者的抗凋亡作用，結果顯示Livin β可顯著抑制依托泊苷（etoposide）和紫外線放射治療（UV irradiation）等誘導的HeLa細胞凋亡，但Livin α則不明顯。更多的研究則認為Livin α和Livin β基因均具有抗細胞凋亡作用，二者可能具有不同的激活途徑有待進一步證實。

許多研究證實［12-16］，Livin蛋白介導細胞凋亡抑制存在不同的調節途徑，通過與激活形式的Caspase 3和Caspase 7結合，抑制其活性。Livin蛋白還可與未加工的或斷裂形式的Caspase 9結合，可抑制由Apaf 1（apoptosis protein activating factor 1）、細胞色素C及dATP誘導的Caspase 9激活作用。 Livin蛋白與Caspase的結合抑制作用具有高度的特異性和親和性，BIR結構域內單個氨基酸的突變即可導致Livin蛋白與Caspase的結合作用的減弱或消失，致使Livin蛋白抗細胞凋亡作用的明顯降低甚至完全喪失，這也許可成為基因治療的調節點。Sanna 等［12］的研究顯示，Livin可激活MAP（mitogen activated protein）激酶JNK1和JNK2，但對JNK3無激活作用，而Livin蛋白對JNK1的激活作用遠遠強于JNK2，并且這是Livin蛋白對抗TNFα和ICE介導的細胞凋亡作用的重要途徑之一。 JNK蛋白家族可直接由MKK4/MKK7激活，但Livin蛋白對JNK1的激活并不依賴于MKK4/MKK7信號途徑，而是通過TAB1/TAK1途徑實現。 TAK1是MAP3激酶之一，在TGFβ1的刺激下TAK1可激活JNK1。 TAB1是TAK1的共活化因子（coactivator），TAB1本身對于JNK1無激活作用，但可促進TAK1介導的JNK1激活作用。Livin蛋白可與TAB1結合，并進一步激活TAK1。此外，Vucic 等［13］證實SMAC（ second mitochondrial activator of caspases， SMAC）及活性肽片段可與Livin蛋白的BIR結構域特異性結合，抑制Livin蛋白與caspase的結合及其抗細胞凋亡作用。因此存在著由SMAC介導的對Livin蛋白抗細胞凋亡作用的負性調節機制。

4 Livin基因治療NSCLC的臨床應用前景

鑒于Livin基因具有明顯的抗細胞凋亡作用以及在腫瘤組織中的特異性表達，人們注意到其與腫瘤發生發展的關系，并開始探討Livin用于腫瘤基因治療的可行性。應用基因轉染技術可獲得穩定表達Livin α和Livin β的NSCLC A549細胞克隆。孫建國等［17］用平板克隆形成實驗研究A549細胞生長情況，用MTT法檢測其對放、化療的敏感性，用細胞周期分析法觀察細胞凋亡情況。結果發現轉染Livin α和Livin β基因后的細胞尤其是表達Livin α的A549細胞，克隆形成能力提高、倍增時間縮短，對多種化療藥物和放射線敏感性降低，10 Gy放射線照射下僅有0.2%細胞發生凋亡。可見 Livin基因參與NSCLC的發生發展，也可能是NSCLC細胞對放、化療耐受的重要機制之一。

CrnkovicMertens等［18］利用基因轉染和特異性小干擾RNA(siRNA)技術，在肺癌SPCA1細胞株中建立Livin異構體α和β特異的基因沉默體系，觀察誘導SPCA1細胞凋亡效應中的不同作用，并用TUNEL法和流式細胞儀檢測細胞凋亡率。結果顯示內源性Livin α和Livin β基因沉默后，SPCA1細胞克隆形成能力較對照組顯著下降，促使SPCA1細胞發生凋亡，表明Livin α和Livin β兩種異構體均能作為誘導肺癌細胞凋亡的分子靶點，通過使Livin基因沉默的靶向誘導肺癌細胞凋亡可作為手術、化療、放療等傳統治療的輔助手段。

由于Livin基因僅在腫瘤組織表達而在正常組織極少表達，Yagihashi等［19］用ELISA法在肺癌患者外周血和腫瘤組織中均檢測到自身Livin蛋白抗體，其組織特異性顯而易見。Hariu等［20］ 用Livin反義核苷酸片段刺激周圍淋巴細胞，發現HLAA24與Livin 7肽具有特殊親和力，Livin蛋白表達陽性的NSCLC患者可檢測到特異性細胞毒T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs），而Livin蛋白表達陰性NSCLC患者則測不到CTLs。結果提示Livin蛋白可成為NSCLC免疫治療的靶點，將Livin 7肽作為免疫制劑具有良好的應用前景。

綜上所述，Livin基因是腫瘤細胞凋亡途徑中的一個信號調節點，其在NSCLC組織中的特異性表達為NSCLC的診斷提供了新的分子標記物，亦可成為NSCLC治療的新靶點［21，22］。目前，人們已能在基因水平上干預因基因表達異常而導致的疾病，尤其是以mRNA為靶標的反義藥物，可抑制和消除致病基因的表達，達到治療的目點。因此，采用反義核苷酸（antisense oligonucleotides）、小分子抑制劑（smallmolecule inhibitors）和免疫介入（immunemediated approaches）等基因治療手段直接阻斷Livin 蛋白與目的分子的結合，可以促使腫瘤細胞的凋亡，為NSCLC的治療開辟新的途徑［23，24］。同時，對NSCLC患者腫瘤組織和外周血免疫細胞的Livin蛋白（受體）及其mRNA表達的聯合檢測，有可能成為NSCLC早期診斷、轉移風險和預后的分子標記物。

參考文獻

［1］ CrnkovicMertens I， Muley T， Merster M， et al. The antiapoptotic livin gene is an important determinant for the apoptotic resistance of nonsmall cell lung cancer cells［J］. Lung Cancer， 2006，54(2):135-142

［2］ Salvesen GS， Duckett CS. IAP proteins: Blocking the road to death′s door［J］. Nat Rev Mol Cell Biol， 2002，3(6): 401-410.

［3］ Kasof GM， Gomes BC. Livin， a novel inhibitor of apoptosis protein family member［J］. J Biol Chem， 2001， 276(5): 3238-3246.

［4］ Lin JH， Deng G， Huang Q， et al. KIAP， a novel member of the inhibitor of apoptosis protein family［J］. Biochem Biophys Res Commu， 2000，279(3): 820-831.

［5］ Vucic D， Stennicke HR， Pisabarro MT， et al. MLIAP， a novel inhibitor of apoptosis that is preferentially expressed in human melanomas［J］. Curr Biol， 2000，10(21): 1359-1366.

［6］ Ashhab Y， Alian A， Polliack A， et al. Two splicing variants of a new inhibitor of apoptosis gene with different biological properties and tissue distribution pattern［J］. FEBS Lett， 2001，495(12): 56-60.

［7］ Tanabe H， Yagihash A， Tsuji N， et al. Expression of survivin mRNA and livin mRNA in nonsmallcell lung cancer［J］. Lung Cancer， 2004，46(3):299-304.

［8］ CrnkovicMertens I， Semzow J， HoppeSeyler F， et al. Isoformspecific seilencing of the Livin by RNA interference defines Livin beta as key mediator of apoptosis inhibition in HeLa cells［J］. J Mol Med， 2006，84(3):232-240.

［9］ 崔 肅，陳東義， 韓力波，等.凋亡抑制蛋白Livin在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義［J］.中國腫瘤臨床，2006，33（5）：249-252.

［10］ 陳 淼，陶曉南，張曉菊.凋亡抑制蛋白Livin在非小細胞肺癌中的表達及其臨床意義［J］.廣東醫學，2006，27（7）：1014-1015.

［11］ 孫建國，廖榮霞，陳正堂，等.一種新的凋亡抑制蛋白Livin在非小細胞肺癌組織中的表達［J］.重慶醫學，2004，33(7):982-984.

［12］ Sanna MG， da Silva Correia J， Ducrey O， et al. IAP suppression of apoptosis involves distinct mechanisms: The TAK1/JNK1 signaling cascade and caspase inhibition［J］. Mol Cell Biol， 2002，22(6):1754-1766.

［13］ Vucic D， Deshayes K， Ackerly H， et al. SMAC negatively regulates the antiapoptotic activity of melanoma inhibitor of apoptosis(MLIAP)［J］. J Biol Chem， 2002，277(14): 12275-12279.

［14］ Yang F， Sarangarajan R， Le Poole IC， et al. The cytotoxicity and apoptosis induced by 4tertiary butylphenol in human melanocytes are independent of tyrosinase activity［J］.J Invest Dermatol， 2000，114(1): 157 -164.

［15］ Andersen MH， Reker S， Becker JC， et al. The melanoma inhibitor of apoptosis protein:a target for spontaneous cytotoxic T cell responses［J］. J Invest Dermatol， 2004，122(2):392-399.

［16］ Yan H，Brouha B， Liu T， et al. Proteolytic cleavage of Livin(MLIAP) in apoptotic melanoma cells potentially mediated by a noncanonical caspase［J］. J Dermatol Sci， 2006，43(3):189-200.

［17］ 孫建國，廖榮霞，陳正堂，等.Livin異構體基因轉染對肺腺癌A549細胞生長及放化療敏感性的影響［J］. 中華結核和呼吸雜志，2005，28（12）：836-840.

［18］ CrnkovicMertens I， HoppeSeyler F， Butz K. Induction of apoptosis in tumor cells by siRNAmediated silencing of the Livin/M LIAP/KIAP gene［J］. Oncogene， 2003，22(51): 8330-8336.

［19］ Yagihashi A， Asanuma K， Kobayashi D， et al. Detection of autoantibodies to livin and survivin in sera from lung cancer patients［J］. Lung Cancer， 2005，48(2):217-221.

［20］ Hariu H， Hirohashi Y， Torigoe T， et al. Aberrant expression and potency as a cancer immunotherapy target of inhibitor of apoptosis protein family，Livin/MLIAP in lung cancer［J］. Clin Cancer Res， 2005，11(3):1000-1009.

［21］ Schmollinger JC， Vonderheide RH， Hoar KM， et al. Melanoma inhibitor of apoptosis protein(MLIAP) is a target for immune mediated tumor destruction［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 2003，100(6): 3398-3403.

［22］ Hassan MA， Braam SR， Kruyt FA. Paclitaxel and vincristine potentiate adenoviral oncolysis that is associated with cycle and apoptosis modulation， whereas they differentlly affect the viral life cycle in nonsmallcell lung cancer cells［J］.Cancer Gene Ther， 2006，13(12):1105-1114.