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1材料與方法

1.1主要試劑及動物細(xì)胞培養(yǎng)液DMEM/F12及DMEM(高糖)、胎牛血清、重組表皮生長因子（EGF）和堿性成纖維生長因子（bFGF-2）均購于GIBCO公司。含綠色熒光蛋白GFP的慢病毒載體表達(dá)質(zhì)粒(pGC-FU)購于GENECHEM公司，pORF-hil-12G2質(zhì)粒購于InvivoGen公司，胰酶、DEPC、Tris堿、EDTA均購于Sigma公司，抗人CD133/PE抗體及抗人CD44/APC抗體購于BDPharmingen公司，BCA蛋白定量試劑盒購于ThermoFisherScientific，實驗用6-8W齡雌性裸鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，由該中心負(fù)責(zé)飼養(yǎng)和管理。

1.2培養(yǎng)、分離、鑒定結(jié)腸癌CSCs結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株購于ATCC，在干細(xì)胞條件培養(yǎng)基中（不含胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，含20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF-2、1×B27和1%青鏈霉素）中篩選培養(yǎng)2周后，流式細(xì)胞儀分選出CD133+/CD44+SW480細(xì)胞作為結(jié)腸CSCs，分析其自我更新及分化。分選出的CSCs用干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)于37°C、5%CO2孵箱中，細(xì)胞增殖實驗、克隆形成能力、成球能力及NOD/SCID體內(nèi)成瘤能力鑒定其“干性”特征[8]。

1.3構(gòu)建IL-12過表達(dá)慢病毒模型及轉(zhuǎn)染CD133+/CD44+SW480細(xì)胞PCR擴(kuò)增含IL-12p70基因片段的pORF-hIL-12G2質(zhì)粒獲得IL-12基因，通過酶切及連接構(gòu)建重組IL-12/慢病毒質(zhì)粒，取陽性克隆搖菌后行PCR鑒定，酶切鑒定及測序。鑒定正確的克隆搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，用除內(nèi)毒素大提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，293T細(xì)胞包裝病毒，IL-12/慢病毒顆粒感染CD133+/CD44+SW480細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞稱為“慢病毒/IL-12細(xì)胞”[8]。

1.4IL-12對結(jié)腸CSCs生物學(xué)特性的影響1.4.1IL-12對結(jié)腸CSCs分化的影響（SP免疫組化試劑盒檢測CK20）為了觀察IL-12對結(jié)腸CSCs的體外分化能力的影響，我們?nèi)∞D(zhuǎn)染IL-12過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒的細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染的CD133+/CD44+SW480在條件培養(yǎng)基中形成的克隆細(xì)胞球，移入含10%胎牛血清培養(yǎng)基中連續(xù)觀察其生長情況，對兩組細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，顯微鏡觀察后照相。結(jié)果判斷：被測細(xì)胞胞漿染色黃-棕色為陽性表達(dá)。

1.4.2IL-12對結(jié)腸CSCs克隆形成能力的影響將轉(zhuǎn)染IL-12過表達(dá)慢病毒質(zhì)粒及未轉(zhuǎn)染的CD133+/CD44+SW480細(xì)胞計數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞濃度。各取10000個兩組細(xì)胞分別接種6孔板中，加入適量條件培養(yǎng)基，5％CO2，37°C培養(yǎng)。每隔1天半量換液1次。顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，7d后終止培養(yǎng)。

1.4.3IL-12對結(jié)腸CSCs侵襲性的影響實驗分組：慢病毒/IL-12轉(zhuǎn)染組；空載體轉(zhuǎn)染組；未轉(zhuǎn)染組（即空白對照）。使用前水化Matrigel基質(zhì)膠，然后基質(zhì)膠包被Transwell小室，置于37°C，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。薯蕷皂甙元處理后24h接種細(xì)胞，1×104/ml細(xì)胞分別接種基質(zhì)膠包被的小室，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞加入上層小室，含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞加入下層小室，將小室置于無菌24孔板中，加入250μl培養(yǎng)基。下室加入500μl培養(yǎng)基，5%CO2，37°C靜置培養(yǎng)48h。取出小室，PBS輕輕淋洗，用棉頭拭子小心移走膜上層的細(xì)胞，95%乙醇侵入到膜下層的細(xì)胞40min。PBS淋洗3次，蘇木素染色。倒置顯微鏡（×200）下計數(shù)微孔膜下層的細(xì)胞，每孔隨機(jī)選擇5個視野，計數(shù)每個視野細(xì)胞數(shù)目，每個實驗重復(fù)3次。14.4IL-12對結(jié)腸CSCs體內(nèi)腫瘤形成能力的影響動物實驗遵循第三軍醫(yī)大學(xué)臨床學(xué)院倫理要求（批準(zhǔn)號ID，SCXK（軍隊）2007015）。6-8周雌性NOD/SCID小鼠培養(yǎng)于無菌環(huán)境中，慢病毒感染后48h，NOD/SCID小鼠（n=15）皮下注射慢病毒/IL-12細(xì)胞5×103，或空載體轉(zhuǎn)染的結(jié)腸CSCs5×103。接種后觀察小鼠毛色、食欲、大小便等基本生命狀況，30d后評估腫瘤形成。試驗結(jié)束后切取腫瘤組織，稱重并作相應(yīng)檢測，游標(biāo)卡尺測腫瘤長短徑，腫瘤體積=長×寬2。

1.5IL-12抑制CD133+CD44+SW480細(xì)胞生存機(jī)制研究

1.5.1Westernblot檢測結(jié)腸CSCs轉(zhuǎn)染前后STAT6、p-STAT6、survivin、IL-12和IL-4蛋白表達(dá)蛋白抽提試劑盒-II提取細(xì)胞上清液總蛋白，濃縮上清至原體積的1/30～1/10，蛋白樣品按照1：4的比例加入5×上樣緩沖溶液，100℃變性5min，分裝。BCA法測蛋白濃度，酶標(biāo)儀測定550nm處吸光度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度。SDS-PAGE垂直電泳，200mA恒定電流轉(zhuǎn)膜80～90min。抗原-抗體反應(yīng)及化學(xué)發(fā)光法顯色，BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)掃描及圖像分析，相對灰度值表示蛋白相對含量。

1.5.2IL-12對結(jié)腸CSCs凋亡的影響收集轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞，PBS洗2次，1000r/min，離心5min，棄上清。用不含EDTA的消化液消化貼壁細(xì)胞。收集的各組細(xì)胞加入500μl結(jié)合緩沖液中重懸細(xì)胞，再加入適量AnnexinV-FITC和PI，同時設(shè)置陰性對照和補(bǔ)償對照（分別單染），室溫避光孵育20min。1000r/min，離心5min，棄上清，加入500μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀測定每個樣本中凋亡細(xì)胞所占百分比，每個實驗重復(fù)3次。腫瘤抑制率=對照組瘤重-治療組瘤重/對照組瘤重×100%。1.6統(tǒng)計學(xué)方法計量資料數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，使用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計。

2結(jié)果

2.1慢病毒-IL-12質(zhì)粒構(gòu)建及在CD133+/CD44+SW480細(xì)胞中表達(dá)前期結(jié)果證實慢病毒-IL-12表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，慢病毒/IL-12細(xì)胞上清液高表達(dá)IL-12mRNA和蛋白[7]，為我們進(jìn)一步探究IL-12體內(nèi)作用及機(jī)制打下基礎(chǔ)。

2.2結(jié)腸CSCs過表達(dá)IL-12對腫瘤球形成能力、侵襲性及分化的影響將CSCs懸浮于無血清的干細(xì)胞培養(yǎng)液中，腫瘤球形成后光學(xué)顯微鏡觀察腫瘤球數(shù)量，結(jié)果顯示IL-12降低了結(jié)腸CSCs腫瘤球形成能力，轉(zhuǎn)染慢病毒-IL-12的CSCs不能形成明顯的腫瘤球（圖1A）。但使用IL-12抗體阻斷后能恢復(fù)腫瘤球形成（圖1B）。空載體轉(zhuǎn)染的SW480CSCs形成的腫瘤球更大更緊密（圖1C），但正常結(jié)腸細(xì)胞WM35不能形成腫瘤球（圖1D）。另一方面，與對照組相比（圖2B），IL-12增加CSCs分化標(biāo)志CK20表達(dá)（圖2A）。與SW480CSCs相比，慢病毒/IL-12轉(zhuǎn)染CSCs的侵襲性降低40%(表1）。

2.3IL-12抑制NOD/SCID小鼠原發(fā)腫瘤生長研究發(fā)現(xiàn)慢病毒/IL-12減緩了CSCs腫瘤生長。慢病毒/IL-12轉(zhuǎn)染的CSCs形成的腫瘤體積顯著低于對照組[（189±21）vs（1785±32）mm3，P<0.05]，質(zhì)量顯著輕于對照組（P<0.01）。

2.4IL-12減緩結(jié)腸CSCs增殖，促使其凋亡IL-12轉(zhuǎn)染也影響細(xì)胞凋亡及增殖。流式細(xì)胞分析顯示，慢病毒/IL-12形成的腫瘤細(xì)胞周期發(fā)生改變，G1期細(xì)胞增加[（68.8±3.6）%vs（52.4±2.8%）]，而S期細(xì)胞降低[（22.6±2.8）%vs（38.6±4.1%）]（圖5A），與對照組相比，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加[(45.2±5.6%vs(4.1±1.2%)]（圖6B）。

2.5結(jié)腸CSCs表達(dá)IL-4和STAT6,IL-12抑制IL-4/STAT6信號途徑Westernblot結(jié)果顯示，CSCs表達(dá)IL-4升高，表明CSCs內(nèi)存在IL-4自分泌信號。值得注意的是，CSCs內(nèi)STAT6被激活。慢病毒/IL-12降低IL-4/STAT6及survivin產(chǎn)生（圖4）。

3討論

結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，隨著人們生活水平提高，飲食結(jié)構(gòu)改變，其發(fā)病率有增加趨勢，尤其在發(fā)達(dá)國家及發(fā)展中國家。直至目前，結(jié)腸癌主要的治療手段仍是手術(shù)切除，且手術(shù)較其他治療效果更佳，尤其是早期腫瘤，但腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)仍是晚期患者治療失敗的主要原因。最近研究表明，CSCs能夠始發(fā)免疫缺陷小鼠腫瘤生長[1-2]，并與腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)相關(guān)。從理論上講，靶向CSCs治療能夠徹底消除腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移，因此靶向CSCs的腫瘤治療策略將比目前的傳統(tǒng)治療方法更有效的根治腫瘤，減少復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，為腫瘤的靶向診治提供了新靶標(biāo)，為根治腫瘤帶來了新希望[14]。免疫抑制仍是多數(shù)預(yù)期較好的腫瘤治療手段的主要障礙，而細(xì)胞因子失衡是機(jī)體免疫功能紊亂的主要原因，并導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展及復(fù)發(fā)[15]。關(guān)于細(xì)胞因子的抗瘤免疫反應(yīng)相關(guān)研究包括IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12等，已有研究表明，IL-12能有效地增多種腫瘤的抗瘤免疫反應(yīng)，但I(xiàn)L-12對CSCs生存及侵襲性的作用并不清楚。本研究報道IL-12低水平表達(dá)/不表達(dá)與結(jié)腸癌進(jìn)展的相關(guān)性，證實IL-12對直接限制CSCs惡性表型的潛在益處。本研究中，我們成功構(gòu)建含IL-12cDNA的重組慢病毒質(zhì)粒，用包裝病毒的工具細(xì)胞293T細(xì)胞包裝純化后，獲得較高滴度的病毒顆粒，將其轉(zhuǎn)染CD133+/CD44+SW480細(xì)胞，慢病毒/IL-12細(xì)胞高表達(dá)IL-12mRNA及蛋白，說明穩(wěn)定轉(zhuǎn)染IL-12的結(jié)腸CSCs系建立，同時也證明慢病毒作為基因研究的載體具有低毒、高效的優(yōu)勢。結(jié)果表明，IL-12損害干性維持部分是因為抑制CSCs增殖；而且，IL-12降低分化標(biāo)志CK20表達(dá)，證實IL-12介導(dǎo)促進(jìn)分化的信號通路；與SW480細(xì)胞相比，慢病毒/IL-12細(xì)胞的侵襲性降低了約40%，表明IL-12顯著抑制CSCs侵襲性。

本研究發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染空載體的CD133+/CD44+SW480細(xì)胞相比，慢病毒/IL-12降低CSCs腫瘤形成，慢病毒/IL-12皮下注射明顯減少腫瘤體積及重量，抑制腫瘤微血管形成，促進(jìn)腫瘤局部缺血壞死，與對照組相比，IL-12轉(zhuǎn)染組的腫瘤增殖細(xì)胞減少，而凋亡細(xì)胞增加，這些發(fā)現(xiàn)證實慢病毒/IL-12能夠降低結(jié)腸癌移植瘤生長，也許對結(jié)腸癌患者有益。IL-12促進(jìn)CSCs凋亡，降低細(xì)胞自我更新及結(jié)腸癌移植瘤生長的機(jī)制并不清楚，最近研究表明“干細(xì)胞”自分泌IL-4，抵抗細(xì)胞凋亡，我們研究證實，CSCs高表達(dá)IL-4和p-Stat6。綜上所述，結(jié)果表明結(jié)腸CSCs中存在IL-4和p-Stat6信號通路，與對照組相比，IL-12使結(jié)腸CSCs分泌IL-4蛋白降低60%，而且，IL-12影響CSCs凋亡及增殖。盡管我們的數(shù)據(jù)支持IL-12水平和CSCs及腫瘤生長之間的逆反關(guān)系，與對照組相比，IL-12明顯降低結(jié)腸CSCs分泌IL-4和p-Stat6蛋白，其潛在機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

作者：尹曉玲陳應(yīng)果張建紅周先云陳華俊趙銀晶梁后杰單位：重鋼總醫(yī)院腫瘤科重鋼總醫(yī)院普外科重鋼總醫(yī)院病理科