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【摘要】目的進行斑點雜交條件的建立及優化。方法采用帶正電荷的尼龍膜對斑點雜交的每一步驟進行優化，包括預雜交液，雜交液，洗滌和封閉液等及各步反應時間，并采用最終確立的條件檢測糖基轉移酶基因多肽：N-乙酰氨基半乳糖轉移酶2（pp-GalNAcT2）在K562、NB4、NIH3T3和SGC7901細胞株中的差異表達以驗證膜雜交條件的可行性。結果建立并優化了膜斑點雜交的條件，本底清晰，結果可靠。結論建立的斑點雜交技術經濟簡便，切實可行。

【關鍵詞】斑點雜交；糖基轉移酶；基因

Theestablishmentandoptimizationofthedotblotprerequisite

【Abstract】ObjectiveToestablishandoptimizethedotblottechnique.MethodsWeusedthepositivelychargednylonmembranestooptimizeexperimentsforthedotblotincludingprehybridizationsolution，hybridizationsolution，washingbuffer，blockingsolutionetal，andthetimesofeverystep.Inordertovalidateitsfeasibility，weanalyzedtheexpressionofppGalNAc-T2indifferenttumorcelllinesbydotblotassayusingtheestablishedhybridizationsystem.ResultsWeestablishedandoptimizedthedotblottechniquewhichhadreliableresultsandlowbackground.ConclusionTheestablisheddotblottechniqueispracticableandeconomical.

【Keywords】dotblot；glycosyltransferase；gene

基因的表達分析研究是分子生物學實驗中較為常用的手段，主要有Northernblot和斑點雜交(dotblot)等，因斑點雜交無需轉膜，且DNA或RNA相對固定在一定的區域內，實驗要求相對簡單，因此斑點雜交更易為實驗者所接受。目前一般均用商品化的試劑盒，但其價格昂貴，不是一般實驗室所能普及，因此我們采用自配的試劑建立并優化了一套斑點雜交方法，無需特殊設備，經濟簡便，結果可靠。

1材料與方法

1.1多肽N-乙酰氨基半乳糖轉移酶2（UDP-GalNAc:polypeptideN-acetylgalactosaminyltransferases2，pp-GalNAcT2EC2.4.1.41）基因的獲得。取pp-GalNAcT2克隆載體轉染DH5α工程菌，篩選白色陽性克隆，抽取質粒，用M13正向、反向引物進行克隆PCR，M13Forward5′-GTAAAACGACGGCCAG－3′，M13Reverse5′－CAGGAAACAGCTATGAC－3′，電泳鑒定結果，可見約1200bp左右的條帶。即獲得相應的ppGalNAc-T2cDN段。

1.2采用T2特異的寡核苷酸探針進行斑點雜交法條件的建立及優化探針序列如下：5′-GAAAGACCTTCATCACAGCAATGGAGAAGAA，與ppGalNAc-T2cDNA序列互補，長31bp。探針合成及探針5′端生物素標記均由上海生工生物工程公司完成。

1.2.1斑點雜交操作程序(1)以上述所得pp-GalNAcT2的cDN段以1NNaOH和200mM的EDTA對比稀釋，使成0.4NNaOH和10mM的EDTA的終濃度。(2)把稀釋的pp-GalNAcT2的cDN段在100℃變性5min，迅速置冰，冰冷10min以上。(3)膜（購自Amersco公司，帶正電荷）用滅菌雙蒸水浸泡10min，懸空晾干。(4)每點2μl把pp-GalNAcT2的cDN段點在尼龍膜上，濕膜在紫外燈下照2min，取出讓膜干燥。(5)雜交時以2×SSC浸膜5min，裝入雜交袋，根據VECTORNIT軟件計算雜交溫度的方法確定雜交溫度為42℃。以每100cm2膜加20ml的預雜交液（50％的去離子甲酰胺，5×SSC，0.1%SDS，0.1%BSA，0.1%PVP，用pH7.5的PB調終體積）于42℃預雜交2～3h。(6)棄去預雜交液，在雜交液（50％的去離子甲酰胺，5×SSC，0.1%SDS，0.1%BSA，0.1%PVP，10％的硫酸葡聚糖，100μg/ml的剪切的鮭魚精DNA，用水調終體積）中加入適量探針，以每100cm2膜加10ml的雜交液于42℃雜交過夜。(7)用足量洗滌液1（2×SSC，0.1%SDS）于42℃洗滌2次，再用洗滌液2（0.5×SSC，0.1%SDS）于55℃嚴謹洗滌2次。(8)用蒸餾水淋洗膜2～5min，然后用封閉液（不同濃度的BSA，0.1MNaCl，0.2%Triton-100，0.1MTris，pH7.5）封閉。(9)倒出封閉液，加入用封閉液配制的適當比例稀釋的卵白素-堿性磷酸酶（購自上海華舜生物工程有限公司），37℃孵育30min。(10)洗滌液3（0.1MTris，0.15MNaCl，0.3%Tween20pH7.5）在37℃洗膜2次，檢測緩沖液（0.1MTris，0.1MNaCl，0.1MMgCl2，pH9.5）平衡，再以每10ml檢測緩沖液加66μlNBT和11μlBCIP(均購自上海華舜生物工程有限公司)的顯色液顯色。(11)顯色結束后以TE終止，用掃描儀獲取圖像。

1.2.2斑點雜交建立及優化程序(1)尼龍膜上不點任何樣品，以下述條件行假雜交反應。雜交液中探針的終濃度為：200ng/ml、100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml；酶的稀釋比例為：1／400、1／800、1／2000、1／5000；封閉液中BSA的終濃度為：2％，封閉2h；雜交后洗滌液1和2分別洗2次，每次1h；封閉后洗滌液洗2次，每次1h；檢測緩沖液平衡1h；顯色30min。

（2）以（1）所獲得的最佳本底，在尼龍膜上點上pp-GalNAcT2的cDN段，其余條件不變，封閉液中BSA的濃度設計成2％、3％和5％三梯度進行雜交反應

（3）以（2）所獲得的最佳條件，改進以下條件：①雜交后洗滌時間每次1h;每次30min；每次10min；②封閉液封閉時間2h;1.5h;50min；③封閉后洗滌時間由每次1h;每次40min;每次20min；④檢測緩沖液平衡時間由1h；30min;10min；⑤顯色以出現清晰的陽性信號，本底最低為尺度，一般在15min左右，時間延長本底升高。

1.3斑點雜交法檢測K562、NB4、NIH3T3和SGC7901細胞株pp-GalNAcT2的表達差異NIH3T3成纖維細胞、胃癌細胞株SGC-7109、白血病細胞株K562和NB4購自上海生化細胞所；RNA抽提試劑TRIZOL、PCR試劑盒、pUCMixDNAmarker和ladder購自Invitrogen公司，六隨機引物購自Takara公司。實驗所用pp-GalNAcT2和β微球蛋白（內對照）引物采用Genetyx軟件設計，并經GenBankBlast同源檢索后由上海生工生物技術公司合成。

β-MG引物序列為：

F：5′-CTCGTGCTACTCTCTCTTTC-3′

R：5′-CATGTCTCGATCCCACTTAAC-3′

預期擴增產物長度330bp。

ppGalNAc-T2引物為：

F：5′-GAAAGAATTAGGAAGGGTCAGAAC-3′

R：5′-CTGTGTCAATGTAAACATAGCTC-3′

預期擴增產物長度為668bp。

采用TRIZOL法抽提K562、NB4、NIH3T3和SGC7901細胞株RNA，測A260/A280比值和電泳圖譜鑒定抽提完整性，測A260定量，六隨機引物逆轉錄制作cDNA。倍比稀釋點膜，用pp-GalNAcT2特異的寡核苷酸探針與膜雜交；同時以上述獲得的K562、NB4、NIH3T3和SGC7901細胞株cDNA加pp-GalNAcT2和β-MG正反向引物行RT－PCR來驗證斑點雜交結果。

2結果

(1)尼龍膜上不點任何樣品所進行的假雜交反應結果如圖1所示，可見以雜交液中探針的終濃度為10ng/ml，酶的稀釋比例為1／5000時本底最低；以此條件，在尼龍膜上點上pp-GalNAcT2的cDN段，封閉液中BSA的濃度設計成2％、3％和5％三梯度，其余條件不變的雜交反應結果如圖2所示，可見以5％的BSA封閉效果最佳；再以上述確立的條件改進雜交反應各步的時間，以簡化實驗，如圖3所示，可見條件2和條件3體系下的結果都是可以接受的，但條件3更為簡化。

(2)以上述確立的雜交反應的條件用斑點雜交法檢測K562、NB4、NIH3T3和SGC7901細胞株GalINAcT2的表達差異，以驗證所確立的條件的實際可行性，結果如圖4所示，pp-GalNAcT2的表達水平依次為K562白血病細胞>胃癌細胞SGC7901>NB4白血病細胞，在NIH3T3成纖維細胞中未檢測到表達。同時再行RT-PCR確證斑點雜交的結果，如圖5，6所示，與斑點雜交結果基本一致。

3討論

我們參照分子克隆［1］和Superarray［2］操作手冊，設計并改進預雜交液和雜交液。由于采用帶正電荷的尼龍膜為支持介質，在堿性條件下更有利于DNA與膜結合，而預雜交的目的是封閉膜上的非特異性結合部位，因此預雜交液采用pH7.5的PB配制并調終體積；而雜交液中的探針要盡量減少與膜的非特異性雜交，因此雜交液用水來調終體積，pH值控制在6.5左右。同時，對雜交過程中所涉及的每一個步驟及試劑的配制，我們都進行優化，最終所確立優化過程如下：采用自配的預雜交液和雜交液，雜交液中探針濃度為10ng/ml，雜交后洗滌液1和2各洗滌2次，每次10min，5%的BSA封閉液封閉50min，封閉后加酶稀釋比為1／5000，封閉后洗滌液洗2次，每次20min，檢測緩沖液平衡10min，顯色以出現陽性信號，本底最低為標準。

圖1不同的探針及酶濃度進行假雜交反應

A：探針濃度為200ng/ml，酶濃度為1/400

B：探針濃度為100ng/ml，酶濃度為1/800

C：探針濃度為50ng/ml，酶濃度為1/2000

D：探針濃度為10ng/ml，酶濃度為1/5000

圖2三種不同BSA濃度顯色對比

(A：BSA為5%；B：BSA為3%；C：BSA為2%)

圖3不同洗滌、封閉和顯色時間的顯色對比

A：條件1；B：條件2；C：條件3

圖47901、NIH3T3、NB4和K562四種細胞的斑點雜交圖

圖示1～6稀釋比例為1、1/2、1/4、1/8、1/16和1/32，每點cDNA上樣量為12μl，原始濃度折算成RNA為2.4μg，采用寡核苷酸探針與之雜交

圖5不同細胞株pp-GalNAcT2的RT-PCR電泳圖譜，其中1：NIH3T3細胞；2：SGC7901細胞；3：NB4細胞；4：K562細胞；M：marker；MG：β微球蛋白(內對照)

Fig6RT-PCRanalysisofpp-Ga1NAcT2expressioninSGC7901，K562，NB4andNIH3T3cells

為進一步檢驗膜雜交條件的可行性，我們用胃腺癌SGC7901細胞、白血病K562、NB4細胞和NIH3T3成纖維細胞的cDNA以一定的稀釋比進行斑點雜交，檢測pp-GalNAcT2在這四種細胞中的差異表達，得到的相對表達水平為：K562白血病細胞>胃癌細胞SGC7901>NB4白血病細胞，在NIH3T3成纖維細胞中未檢測到表達。pp-GalNAcT2主要表達于富含粘蛋白的組織細胞中［3］，一般說來，能分泌較多粘蛋白的細胞pp-GalNAcT2有較高表達，如正常胃和大腸粘膜，胃癌細胞株SGC7901中pp-GalNAcT2mRNA的表達很高是可以理解的；NIH3T3是一種成纖維細胞，來源

于非上皮組織，不分泌粘蛋白，所以其pp-GalNAcT2的表達甚低。K562和NB4均是白血病細胞，其pp-GalNAcT2表達也較高，其確切的生物學意義有待闡明。雖然我們采用了嚴謹的洗滌條件但也不排除雜交液中的探針與cDNA之間發生非特異性雜交，因此對每種細胞的cDNA行pp-GalNAcT2特異的RT-PCR，以β-MG為內對照，對所得的T2和β-MG條帶掃描定量，比較四種細胞T2的相對表達高低，結果是與斑點雜交一致，證明斑點雜交結果是可信的，其雜交條件是可行的。另外，RT-PCR中檢測到在NIH3T3細胞中有微量的T2表達，而在斑點雜交中未檢出，說明顯

色法斑點雜交在檢測低表達基因的靈敏度上可能還不夠，可能需要增加上樣量或換用靈敏度更高的顯影或檢測系統來檢測低表達基因的表達水平。但是，增加cDNA上樣量會帶來相當多的問題，主要是RNA的逆轉錄的效率，因為增加cDNA上樣量必然需要增加逆轉錄所需的RNA用量。當然，也可以通過幾管cDNA濃縮獲得，但操作相對煩瑣。另外，可以直接做RNA的斑點雜交，這樣增加RNA上樣量相對容易，但RNA容易降解，操作要求高，復雜，不如cDNA的斑點雜交簡便，因此，相對可行的方法可能是根據實驗所需，采用所建立的cDNA斑點雜交體系，用不同靈敏度的檢測系統，如化學發光法、同位素標記法或熒光標記法等檢測不同的基因表達。

總之，我們成功地建立了cDNA斑點雜交體系，無需特殊的儀器設備，試劑成本低廉；陽性信號清晰，結果可靠，有助于在基因的差異表達等研究中的應用。

【參考文獻】

1J.薩姆布魯克，E.F.弗里特，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆實驗指南.北京:科學出版社，1993，362-395.

2.

3KudoT，IkeharaY，TogayachiA，etal.Up-regulationofasetglycosyltransferasegenesinhumancolorectalcancer.LabInvest，1998，78(7):797-811.