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本文作者：李艷嫦1孔靜月1吳九玲2王琳3任小平3劉瓊光1作者單位：1.華南農業大學資源環境學院2.廣東省海豐縣農業局3.廣東省農業廳植檢站

材料與方法

1供試菌株

西瓜細菌性果斑病菌野生菌株Aac1和抗利福平菌株RifAac，均由華南農業大學植物細菌研究室提供。

2培養基

Aac擴大培養培養基（普通培養基）：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl5g，瓊脂20g，水1000mL，pH7．4～7．8。Aac分離培養的培養基：參照改良ASCM培養基［11］并略作修改。KH2PO40．5g，K2HPO4•12H2O2g，（NH4）2SO42g，酵母膏10g，MgSO4•12H2O29mg，CaCl251mg，Na2MoO4•2H2O25mg，瓊脂20g，水1000mL，滅菌后每1L培養基中加入溴甲酚紫0．6mL（15mg／mL），氨芐青霉素20mg，新生霉素10mg，放線菌酮25mg，無水乙醇10mL，pH7．0～7．2。Aac富集培養基（普通液體培養基）：除不含瓊脂外，其成分與普通培養基相同。牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉NaCl5g，蒸餾水1000mL，pH7．4～7．8。

3人工模擬接種

1）健康種子。將新紅寶西瓜品種的健康種子（由廣東省農業廳提供）分成3等份，每份500粒，取2等份浸入1×109cfu／mL的抗利福平RifAac菌液中1h，在自然條下室內晾干后，分別轉入滅菌膠袋中，1份接菌的種子放置在室溫下，另1份接菌種子置于4℃冰箱保存；接無菌水的那份種子也置于4℃冰箱保存，作為陰性對照。定期分離和檢測種子上Aac存活情況。2）土壤。將種植過水稻、番茄、煙草和塘泥等不同來源的普通土壤各5kg均勻混在一起，經PCR檢測不帶西瓜果斑病菌Aac，將混合土裝入潔凈盆缽中，每盆裝土15kg。設無病殘體土壤和有病殘體土壤（每盆埋入新紅寶西瓜藤和瓜皮約500g）。將活化后并培養48h的RifAac菌液，調整菌液濃度約1×109cfu／mL，2009年9月30日進行人工接種。每盆接種200mL菌液，以不接菌為對照，隨后淋自來水使土壤保持濕潤狀態。3）田水。田水取自室內盆栽水稻盆缽中的水，摻入自來水，每盆10kg田水，接種200mL菌液。將接種后的盆缽置于露天開放的自然環境中，期間定期澆自來水，以保持土壤一定濕度。定期分離和檢測土壤里Aac存活情況。

4Aac的分離

分別采用直接分離、菌落PCR和常規PCR3種方法對人工接種的Aac進行檢測，若能直接分離出Aac，則不進行富集培養；若不能直接分離出Aac，則進行富集培養后再分離，獲得的單菌落進行菌落PCR（Bio－PCR）；若富集培養后無法再分離得到目標菌，則提取樣品DNA進行常規PCR檢測。定期分別取人工接種的種子10g、土壤10g和水10mL，研缽內碾碎后，加入100mL無菌水，進行10倍梯度稀釋，各取50μL均勻涂布于含100μg／mL利福平的ASCM選擇性平板上，30℃下培養3～4d，觀察RifAac菌株生長情況。如果直接分離不到病菌，則先將樣品于Aac富集培養基培養24h后，再用選擇性平板分離。將上述選擇性平板上獲得的單菌落進一步PCR驗證。

5Aac的PCR檢測

菌落PCR和常規PCR采用Aac的特異引物分別為WFB1（5′－GACCAGCCACACTGGGAC－3′）和WFB2（5′－CTGCCGTACTCCAGCGAT－3′）［12］，PCR片段大小為360bp。西瓜種子DNA、土壤DNA和田水DNA的提取采用試劑盒方法進行，試劑盒PowerSoilTMDNAIsolationKit購自MOBIO公司。TaqReactionBuffer10×（2．5U／μL），TaqDNAPolymerase（2．5U／μL），dNTPMixture（2．5mmol／L），購于天根生化科技有限公司。采用25μL的PCR反應體系：10×PCRBuffer2．5μL，dNTPs2μL，WFB1引物1μL，WFB2引物1μL，模板1μL，Taq酶0．4μL，ddH2O17．1μL。反應條件：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，35個循環，72℃延伸10min。PCR產物在1．0％瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

結果與分析

1Aac在種子上的存活期

采用人工接種抗利福平RifAac菌株，每隔1個月左右對種子進行選擇性平板直接分離、Bio－PCR以及提取種子DNA檢測，以確定種子中的Aac存活情況。RifAac菌株在含利福平的改良ASCM培養基選擇性平板上的菌落灰白色、圓形、光滑、隆起、不透明，直徑1～2mm。分離結果表明，接種90d后，采用選擇性平板能分離出Aac（表1），接種120d直接分離不到Aac，但富集培養后菌落PCR能檢測到病菌（圖1），150d后室溫保存的種子3種方法都檢測不出Aac，而低溫保存的種子只有種子DNA能檢測出（圖2），180d后常規PCR檢測不到Aac，說明在低溫條件下保存種子中的病原細菌存活時間比室溫長，至少能存活4個月。

2Aac在土壤和田水中的存活期

1）分離檢測。直接分離法從模擬接種土壤、病殘體土壤和田水3種場所中分離，并在ASCM選擇性培養基上獲得的疑似單菌落，通過PCR檢測驗證，證實為Aac活菌。結果表明，田水中1個月后直接分離不到Aac，2個月后Bio－PCR能檢測到，3個月后，田水中PCR檢測不到病菌。接種后3個月的病殘體土壤和無殘體土壤中都能分離到Aac，4個月Bio－PCR能檢測到Aac。2）PCR檢測。由于Aac在自然環境中易受環境因素和其他微生物的影響，人工模擬接種后，Aac在3個月后數量減少，用常規分離培養方法靈敏度有限，無法直接分離或富集分離出目標菌Aac，因此，本試驗進一步選用靈敏度更高的PCR檢測方法，觀察Aac在環境中的存活情況。采用試劑盒方法提取土壤細菌總DNA，用Aac特異性引物PCR檢測不同場所中Aac的存活情況。從接種后的第4個月起，提取供試土壤DNA進行PCR檢測。結果表明，接種后第8個月沒有病殘體的土壤中仍然檢測到Aac，在第10個月則檢測不到；在接種含病殘體的土壤中12個月之內均能檢測到Aac，表明Aac在病殘體土壤中的存活期更長，至少可達12個月，帶菌土壤中的Aac存活期可長達8個月（圖3）。

討論

大量的研究結果表明，西瓜細菌性果斑病主要通過種子傳播，因而病害防治的策略重點應在選用無病種子或種子處理［13－14］。盡管如此，西瓜種子的藥劑處理除了存在環境污染外，仍然不能完全清除種子上的病原菌［14－16］。Shirakawa等［17］認為，如果西瓜種子中只要有1個菌落形成單位的Aac，在適宜的環境條件下就可以導致幼苗的發病，因此明確病原細菌在種子上的存活期，對于指導種子處理具有重要參考價值。本試驗通過篩選抗利福平的RifAac菌株，人工接種西瓜種子，定期檢測不同環境條件下病原菌在種子中的存活情況。結果表明，接菌30、60、90d后，直接分離、Bio－PCR都能在西瓜種子中檢測出Aac，但接菌120d后，只有Bio－PCR和提取種子DNA的方法才能檢測出Aac，150d后室溫和低溫保存的種子Bio－PCR都檢測不到Aac，但低溫保存的種子DNA能夠用PCR檢測出Aac，說明Aac在種子上常溫下至少可以存活4個月，4℃低溫下至少可存活5個月。然而，Shirakawa等［17］的研究結果表明，Aac在種子中4℃下可以存活更長時間，其原因可能是由于研究方法和取樣的不同所致。Shirakawa等觀察的是田間感染了病菌的種子，病原細菌可能已經侵入到種子內部；本試驗是通過人工接種，病菌可能都在種子表面，其存活期可能沒有在種子內部時間長，這個推測尚需進一步研究證實。此外，帶菌的種子散落在田間后，長出的西瓜植株、殘留在田間的染病瓜皮和田間可能帶菌的葫蘆科雜草等，都是感染下茬西瓜的重要菌源［2］，但該病菌是否可以在其他雜草或土壤中殘存，其存活期的長短還不清楚。盡管有文獻記載，病菌在埋土中的西瓜皮上可存活8個月，在病殘體上可存活24個月［18］，但缺乏試驗證明，目前尚未取得一致認同。本試驗通過人工模擬接種，結合選擇性分離、Bio－PCR和常規PCR方法，觀察了Aac在無植物殘體土壤、含病殘體土壤和田水中的存活情況。結果表明，Aac在田水中只能存活2個月，在含病殘體的土壤中可存活12個月。盡管病菌存活期時間的長短與病殘體分解的程度有關，但本試驗結果表明，Aac在不含殘體的土壤中存活期可達8個月。西瓜細菌性果斑病初侵染源除了種子之外，還有土壤、病殘體、其他雜草和寄主［19］。采用不同越冬菌源的Aac和接菌方法進行致病力試驗，結果表明病果浸出液、干病葉、濕病葉和帶菌土壤越冬后的菌源都有致病力，且以帶菌土壤和干存越冬病葉越冬的菌源致病力較強［20］。選擇無病西瓜種子是西瓜果斑病防治的關鍵，生產上應根據實際情況，特別是對表面污染了病菌的西瓜種子，可選擇合適的方法對種子進行滅菌處理。如果種子不作任何處理，則務必要確保西瓜種子中果斑病細菌已經死亡或無危害性。此外，深耕翻土、清除田間帶菌殘株、土壤消毒、土壤閑置或與非寄主作物輪作12個月以上，結合防止田間灌溉水污染等措施，均能有效降低西瓜細菌性果斑病的初侵染來源，控制西瓜果斑病的發生和流行。因本試驗采用人工模擬接種的方法，在不同接種體或場所上接種的病菌濃度和場所的放置環境與大田情況可能不同，故研究結果僅為西瓜果斑病的防治提供參考。有關西瓜細菌性果斑病的其他初侵染來源，如雜草或其他植物等，還有待進一步研究。