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本文作者：王亞男1曾希柏1俄勝哲2白玲玉1李蓮芳1蘇世鳴1沈靈鳳1作者單位：1中國農業科學院農業環境與可持續發展研究所2甘肅省農業科學院土壤肥料與節水農業研究所

結果與分析

1氨氧化細菌的T-RFLP分析

將土壤樣品的amoA功能基因用MspI內切酶酶切后，得到4個主要片段長度，分別是60bp、156bp、235bp和256bp。對主要片段進行分析后得到圖1。可以看出，不同施肥對0~20cm和20~40cm土層中156bp和256bp兩個片段百分比變化的影響較小。156bp在各個樣品中平均約占5%，最大不超過9%；256bp在各個樣品中平均約占10%，最大不超過17%。但是，不同處理間TRFs的主要片段60bp和235bp則有較明顯差異，其中235bp片段所占比例較高，最大達到62%。同一土層中，235bp片段一般以CK和NPK處理較高。不同土層比較，0~20cm土層中60bp片段以M處理最高，235bp則以NPK處理最高；20~40cm土層中60bp片段以MNPK處理最高，235bp則以CK處理最高。對相關結果進行統計分析（表3）可以看出，施肥對60bp、235bp和256bp片段的百分比都有顯著影響，而土壤層次則主要影響60bp和235bp兩個片段。不同施肥處理間片段百分比的變化幅度明顯要大于土層間的變幅。說明在設施栽培條件下，土壤中氨氧化細菌的狀況受施肥的影響更大。

2土壤氨氧化細菌的系統發育樹

在本研究中，挑選氨氧化細菌片斷較豐富的樣品（MNPK第二個重復的0~20cm土層樣品）進行克隆文庫構建。選取52個陽性克隆子進行測序分析，將克隆測序的結果與典型氨氧化細菌進行比對，構建系統發育樹（圖2）。圖2所示的測序結果顯示，本試驗所處條件下土壤中氨氧化細菌的所有序列均屬于β-變形菌門，主要包括Nitrosospiracluster3a、Nitrosospiracluster3b和Nitrosomanascluster7三個屬。其中屬于Nitrosospiracluster3a的片段包括60bp、235bp和256bp，屬于Nitrosospiracluster3b的片段包括60bp和156bp，還有一部分60bp的片段屬于Nitrosomanascluster7。235bp和256bp為Nitrosospiracluster3a氨氧化細菌特有，156bp為Nitrosospiracluster3b氨氧化細菌特有，而60bp片段則分布在3個cluster中。Ni－trosospiracluster3a和Nitrosospiracluster3b這兩個屬的氨氧化細菌的序列由于都屬于Nitrosospiracluster3，其相似度高，很難通過酶切分型將其完全區別。為進一步將屬于Nitrosospira和Nitrosomanas這兩個屬的氨氧化細菌分開，選用BsaJI酶對測得的序列作進一步分析。發現屬于Nitrosomanascluster7的氨氧化細菌用BsaJI酶酶切后，酶切片段長度為319bp，而屬于Nitrosospiracluster3a和Nitrosospiracluster3b的氨氧化細菌酶切后得到的主要片段長度為60bp、67bp、118bp、155bp和484bp，利用MspI和BsaJI這兩種內切酶對測序結果進行統計分析，可以將氨氧化細菌Nitrosospira和Nitrosomanas兩個屬的片段加以區別。

3氨氧化細菌群落結構與土壤理化性質相關性

氨氧化細菌群落結構與土壤理化性質的相關性列于圖3。可以看出，氨氧化細菌的群落結構與土壤有機質（r=0.461，F=23.915，P=0.002）、全磷（r=0.304，F=1243，P=0.002）、pH值（r=0.241，F=8.883，P=0.004）和硝態氮（r=0.177，F=6.020，P=0.018）含量等均呈顯著相關，而與土壤全鉀含量無相關性。由于土壤有機質和pH值等理化指標的變化在很大程度上與施肥及管理等因素密切相關，可以認為土壤中氨氧化細菌的群落在很大程度上受耕作和施肥的影響。

4施肥對氨氧化細菌豐度的影響

本研究中，對不同施肥處理下土壤中氨氧化細菌amoA基因拷貝數的變化情況進行了相應分析，其結果如圖4。不同施肥處理、不同土層的氨氧化細菌amoA基因拷貝數均有明顯差異。其中，CK和M處理土壤中氨氧化細菌amoA基因拷貝數均較低，而1/2MNPK和NPK處理土壤中amoA基因拷貝數則一般均較高。MNPK處理下土壤中氨氧化細菌的基因拷貝豐度并沒有因為施肥量較高而達到最大，在0~20cm土層中反而低于1/2MNPK和NPK處理，在20~40cm土層中亦低于1/2MNPK處理。在0~20cm和20~40cm兩個土層中，氨氧化細菌的豐度均以1/2MNPK處理最高，amoA基因拷貝數分別達到每克土9.95×107拷貝數和每克土6.65×107拷貝數，比CK處理增加105.0%和315.3%。根據氨氧化細菌amoA功能基因拷貝數的統計分析結果，施肥對氨氧化細菌豐度具有顯著影響（P=0.028<0.05），而不同土層間比較，氨氧化細菌豐度無明顯差異（P>0.05）。

討論

本文采用PCR-TR－FLP與定量PCR技術相結合的方法，研究了設施菜地不同施肥下氨氧化細菌的種類及豐度變化。氨氧化細菌功能基因amoA經過MspI酶酶切后主要得到了4個片段，且每個樣品中都包含這4個片段，只是它們所占百分比不同。將T-RFLP結果與克隆測序結果結合分析后發現，研究土壤中氨氧化細菌包括Nitrosospira和Nitrosomanas兩個屬，Nitrosospira屬的氨氧化細菌為優勢種群，占90%左右，Nitrosomanas屬的氨氧化細菌僅占10%左右。該結果與Kowalchuk等[19]報道的土壤中硝化細菌以Nitrosospira屬為主，而非Nitroso－manas屬的結論一致，也與很多研究[20]認為的Ni－trosospira細菌在氨氧化過程中發揮主要作用一致。但與Fan等[21]和Li等[22]報道不盡一致的是，本研究中除以Nitrosospira屬氨氧化細菌為主外，還含有少部分Nitrosomanas屬的氨氧化細菌，說明受設施環境及施肥的影響，氨氧化細菌的種類可能會變得更豐富。本研究設施土壤中大部分氨氧化細菌屬于Nitrosospiracluster3，各處理中均以Nitrosospiracluster3a和Ni－trosospiracluster3b為優勢種群，只是所占比例有差別。一般認為，不同氮素濃度會引起氨氧化細菌種屬的改變，這是由于不同類型氨氧化細菌對基質[23]和銨濃度的敏感度不同所致[24]。Kowalchuk的研究中施用氮肥刺激了Nitrosospiracluster3的生長，導致其成為土壤中的優勢菌屬[25]，Belse等[26]亦認為在銨濃度較高的條件下，Nitrosospiracluster3能夠更好地生長。但是，Avrahami等[17]指出Nitrosospiracluster3不一定需要在較高銨濃度下才能成為優勢菌屬，Chu等[8]發現在不施肥處理下Nitrosospiracluster3也是優勢菌屬。本研究亦證實，Nitrosospiracluster3不僅在施用高氮條件下是優勢菌屬，即使在氮肥施用適中、甚至不施氮肥的對照處理中，Nitrosospiracluster3也是優勢菌屬。Nitrosospiracluster3a和Nitrosospiracluster3b對銨濃度的要求表現出不同的趨向性[17]。Chu等[8]研究表明，長期施用氮肥后，土壤中Nitrosospiracluster3a氨氧化細菌的豐度明顯增加。本研究中，由于60bp片段同時屬于Nitrosospiracluster3a和Nitrosospiracluster3b兩個屬，即使用BsaJI酶切仍不能將兩個屬的完全分開，所以不能準確區分出Nitrosospiracluster3a和Nitrosospiracluster3b這兩個屬百分比的變化。有機質可以為自養型氨氧化細菌的生長提供豐富的養分，因此有機質含量豐富的土壤中，如表層和施用有機肥的土壤中，氨氧化細菌的多樣性和豐度也較高。施肥會引起土壤pH值的變化，尤其是長期施用化肥會導致土壤酸化。很多研究表明，土壤pH值是影響硝化作用的重要因素[13]，低pH值可限制硝化細菌的生長，不利于硝化過程的進行，從而影響土壤氮素循環。pH值也是影響氨氧化細菌和古菌群落多樣性、數量和活性的主要因素[27]。本研究通過T-RFs片段分析同樣得出有機質和pH值與氨氧化細菌群落結構具有十分顯著的相關性。氨氧化細菌不僅對土壤中氮素轉化具有十分重要的作用，而且也是土壤中更容易受到外界條件變化影響的一類微生物。傳統的計數培養法很難精確估算出環境條件對氨氧化細菌這類難以在人工條件下培養的微生物豐度的影響。采用熒光定量PCR技術不僅可以解決以上問題，而且可以準確反映微生物的細微變化。運用熒光定量PCR技術研究氨氧化細菌數量的變化已經有很多報道，如Okano等[11]利用real-timePCR研究了不同銨濃度對氨氧化細菌數量的影響，發現其數量隨銨濃度的增加而增加，最高達到每克土6.6×107個細胞。Hermansso等[10]的研究也指出，施氮處理的土壤中氨氧化細菌數量達到每克干土6.2×107拷貝數，比不施肥處理的土壤高出3倍多。在本研究中，氨氧化細菌豐度的最大值并不是出現在施肥量最高的MNPK處理，而是出現在1/2MNPK處理0~20cm土層，amoA基因數達到每克干土9.95×107拷貝數。該結果與前人的結果并不完全一致[11]，說明對于設施菜地而言，由于環境條件與大田差異明顯，施肥的影響也可能因此而有所差別。同一施肥處理下，一般0~20cm土層中氨氧化細菌的豐度高于20~40cm土層，這是因為表層土壤中氧氣相對充足且土壤肥力較高，更適宜好氧型氨氧化細菌的生長。

結論

本文采用T-RFLP和定量PCR結合的技術，系統研究設施菜地不同施肥處理后氨氧化細菌的群落結構和豐度的變化。結果表明：（1）設施菜地土壤中氨氧化細菌的優勢菌為Ni－trosospiracluster3屬，但也包括有少量的Nitroso－manascluster7屬氨氧化細菌，意味著在設施栽培與施肥條件下土壤中氨氧化細菌的種類可能比大田更豐富。（2）施肥對土壤中Nitrosospiracluster3a和Ni－trosospiracluster3b的豐度和相對百分比具有顯著影響。相關分析結果表明，有機質含量和pH值均是導致氨氧化細菌群落結構差異的主要原因。熒光定量PCR技術分析發現，施肥是導致氨氧化細菌豐度差異的主要原因。本研究結果為進一步開展氨氧化細菌參與的設施菜地氮素循環與轉化研究，制定設施菜地合理施肥量等，均具有重要的參考意義。