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本文作者：王亞飛1張金艷2作者單位：1.黑龍江八一農(nóng)墾大學文理學院2.黑龍江八一農(nóng)墾大學教務處

紫花苜蓿素有“牧草之王”的美譽[1]，它是世界上栽培最早、分布面積最廣的一種優(yōu)質(zhì)豆科牧草。苜蓿中富含蛋白質(zhì)、維生素、無機鹽及促生長因子，其鮮草中粗蛋白質(zhì)含量為4.5%~5.9%，干草中蛋白質(zhì)含量約為15%~25%，比玉米高1~1.5倍[2]。近年，由于食用農(nóng)藥殘留超標的蔬菜而引起食物中毒的事件時有發(fā)生，為了阻止有毒蔬菜進入市場，在蔬菜上市前進行農(nóng)藥殘留快速檢測是比較可行的辦法。目前，快速檢測農(nóng)藥殘留用植物酯酶都是以糧食作物如小麥[3]、大豆[4]、蕎麥、豌豆、玉米[5]等為酶源，檢測成本雖然比動物酶源低，但畢竟需要消耗糧食。本文試驗從價格更加低廉的苜蓿中提取植物酯酶，進行分離、純化，并系統(tǒng)地對該酯酶的動力學特性及農(nóng)藥檢測效果進行研究，為尋求植物酯酶新酶源提供依據(jù)。

1儀器與試劑

1.1儀器

UV-2802PCS型紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；高速冷凍離心機：法國JOUAN；電子天平：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-(S)6數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市友聯(lián)儀器研究所。

1.2試劑

硫酸銨、磷酸二氫鈉、磷酸氫鈉等：國產(chǎn)分析純；2,6-二氯靛酚：德國。

2實驗材料與方法

2.1實驗材料

粗酶的提取：稱取100g苜蓿嫩葉，用研缽研成勻漿，按料液比(w/v)1:10加入pH7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液，移入錐形瓶中震蕩10min，4層紗布過濾，濾液用4000~6000r/min的速度低溫離心15min，取上清液，將粗酶液保存在4℃冰箱中備用。分級純化：在不斷攪拌下，每升上清液中慢慢加入215g硫酸銨(0.3飽和度)，在1h內(nèi)加完后置于4℃冰箱中過夜。次日將上清液用虹吸管吸出，下面渾濁液用4000r/min的速度低溫離心15min，棄沉淀合并上清液。在不斷攪拌下，每升上清液中慢慢加入215g硫酸銨(0.6飽和度)，在1h內(nèi)加完后置于4℃冰箱中過夜。次日，將上清液用虹吸管吸出，沉淀用5000r/min的速度低溫離心15min，棄上清液，保留沉淀。將沉淀溶于少量蒸餾水中，裝于透析袋(分子量大于10000u)中，4℃下置于pH7.0NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中透析24h，中間換4次緩沖溶液，直至無SO42-析出為止(用氯化鋇檢驗)。將沉淀溶于1LpH7.0NaH2PO4-Na2HPO4緩沖溶液中。

2.2試驗方法

不同農(nóng)藥最低檢測限(LDC)的確定：根據(jù)所用UV-2802PCS型紫外可見分光光度計的誤差范圍，以可以檢測到的最小吸光度對應的農(nóng)藥濃度為初定檢測限，在此濃度下與空白液進行t檢驗(n=6)，用SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)處理數(shù)據(jù)，從而確定LDC。結果見表1。

3結果與分析

3.1最大吸收波長的測定及反應進程曲線

取3.5mL酶液于錐形瓶中，在40℃水浴中恒溫10min，加入0.5mL顯色劑，在40℃水浴中繼續(xù)恒溫20min，在550~640nm范圍內(nèi)改變波長，測定不同波長下酶促反應產(chǎn)物的A值。從圖1可見，最大吸收峰在605nm，因此在比色分析中，測定波長選擇605nm。取3.5mL酶液于錐形瓶中，在40℃水浴中恒溫10min，加入0.5mL顯色劑，40℃水浴中繼續(xù)恒溫。在605nm波長下，分別測定顯色10、20、30、40、50、60、70、80min時產(chǎn)物的A值。結果見圖2。圖2結果顯示，在0~20min內(nèi)反應速率增大得很快，20min后，反應速率增加緩慢。本實驗選擇1~4min吸光度值的變化進行酶促反應計算。

3.2鹽的種類和濃度對酯酶活力的影響

改變提取劑的種類、濃度及pH值提取苜蓿酯酶，分別測定總酯酶活力和比活力，結果如圖3和圖4所示。從圖3和圖4中可見，用pH值7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液提取的酶液活性和比活力均最高。

3.3溫度對酯酶活力的影響

當其他試驗條件不變時，分別測定顯色溫度為4、10、20、30、40、50、60、70、80℃時產(chǎn)物吸光度值。溫度對酯酶活力的影響如圖5所示。從圖5中可見，40℃時，酯酶活性最高。

3.4pH值對酯酶活力的影響

在40℃時，分別測定pH值為4.0~9.0的緩沖體系中的酯酶活力，結果如圖6所示。由圖6可見，苜蓿酯酶在pH值6.5~7.5范圍內(nèi)活力較大，在pH7.0的緩沖體系中活力最大。

3.5料液比對酯酶活力的影響

4℃下用pH7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液為提取劑，以不同料液比(1:1~1:40)提取苜蓿酯酶，并測定總酯酶活力和比活力，結果如圖7所示。從圖7中可以看出，當料液比在1:1~1:10范圍時，隨著料液比的增加，苜蓿總酯酶活力也隨之增大，這是因為料液比增大，酯酶溶出充分。而當料液比達到1:10后再增大時，總酯酶活力不再增加，可能是稀釋倍數(shù)過大造成的。

3.6提取時間對酯酶活力的影響

提取率隨著提取時間的延長而增高，但酶活性會隨著時間的延長而降低。為了確定合適的提取時間，固定其他提取條件和顯色條件，改變提取時間，以確定本試驗最佳提取時間，結果如圖8所示。從圖8中可以看出，提取前10min，酯酶活力隨提取時間的增加而增大，10min后隨著提取時間的延長而逐漸降低，在提取10min到30min時，酶活相差不大，過了30min后酯酶活性降低速度加快。這是因為延長提取時間，有利于酯酶的溶出，而時間過長，酶活力損失過大。

3.7幾種常見的有機磷農(nóng)藥的最低檢測限(LDC)

從表1中的結果可看出，苜蓿酯酶對上述5種有機磷農(nóng)藥的LDC除甲拌磷外均遠小于我國和歐盟對上述農(nóng)藥最高允許殘留量(MRL)的要求，雖然甲拌磷的檢測限高于要求，但遠低于目前快速檢測用小麥酯酶對甲拌磷的檢測限0.166μg/mL[6]。

4結論

本實驗從來源廣、價格相對低廉的苜蓿中提取植物酯酶，實驗表明用pH7.0的0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液提取的酯酶活性最高，40℃時酯酶反應活性最大。苜蓿酯酶對久效磷、氧樂果、甲基對硫磷、甲胺磷、甲拌磷的最低檢測限分別為0.024、0.050、0.009、0.003、0.002μg/mL。除甲拌磷外，對其余4種有機磷農(nóng)藥放入檢測限均低于于我國和歐盟對上述農(nóng)藥最高允許殘留量的要求。由于本實驗只是以5種有機磷農(nóng)藥為例，所以該結論還需進一步選取更多種類的有機磷農(nóng)藥加以驗證。