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免疫磁分離技術具有簡單、快速、特異性強等優點,與其它檢測方法(如電化學、PCR、ELISA等)聯用,已廣泛應用于細胞的分離提純、靶向釋藥、致病菌檢測等研究領域。實驗中以滅活的AIVH5N1為檢測對象,首先在H5抗體表面偶聯生物素,使之與表面修飾鏈霉親和素的150nm磁珠結合,以實現對AIVH5N1的純化和富集。在最佳實驗條件下,對純病毒樣品和雞的咽拭子樣品進行了檢測。

1搖實驗部分

1.1搖儀器與試劑

金叉指陣列微電極(中國科學院半導體研究所),指電極對數為25對,基底為石英片(3cm伊1cm),指電極的寬度和間距均為15滋m,厚度為0.2滋m,長度為3mm。鏈霉親和素修飾的納米磁珠(直徑150nm,美國R&D公司);生物素化試劑Sulfo鄄NHS鄄Biotin、透析卡(美國Pierce公司);KPL洗液(美國KPL公司),本實驗中使用的測量溶液為KPL洗液按1頤200000稀釋而成;磷酸鹽緩沖液(PBS,美國Sigma公司),本實驗中使用的PBS緩沖液濃度為10mmol/L,pH為7.4;牛血清蛋白(BSA,北京博翔興旺科技有限公司);無水乙醇(分析純,北京化工廠);NaOH、HCl(分析純,國藥集團化學試劑有限公司);實驗用水均由美國Millipore公司生產的Mill鄄Q制得(18.2M贅•cm)。抗H5亞型AIV單克隆抗體、滅活的AIVH5N1/H1/H9亞型病毒、滅活的新城疫病毒、健康雞的咽拭子皆由華南農業大學獸醫學院提供。實驗中純病毒樣品采用PBS緩沖液按濃度梯度對原病毒溶液進行稀釋;拭子樣品采用健康雞的咽拭子在PBS緩沖液中的浸出液按濃度梯度對原病毒溶液進行稀釋。

1.2搖檢測原理及過程

本研究的實驗過程(圖1)主要包括4個步驟:生物素化抗體、制備H5抗體包被的免疫磁珠、捕獲并分離目標病毒、阻抗測量。Sulfo鄄NHS鄄Biotin可與蛋白質鏈上的氨基形成穩定的酰胺鍵,從而對H5抗體進行標記。通過生物素與鏈霉親和素之間的高度親和力,使標記生物素的H5抗體與表面修飾鏈霉親和素的150nm磁珠結合,形成H5抗體包被的免疫磁珠。當樣品中存在目標病毒AIVH5N1時,免疫磁珠能夠捕獲H5N1病毒,形成磁珠鄄抗體鄄病毒復合物。該復合物在外加磁場作用下定向移動并吸附于管壁內側后,移除廢液,從而實現了目標病毒與樣品中其它非目標分析物的分離。對照品懸液在制備過程中使用PBS緩沖液替代病毒溶液,其它制備步驟與上述樣品懸液的制備步驟相同。采用叉指陣列微電極分別測量對照品和樣品的阻抗譜,通過兩者間的差值判斷樣品中是否含有H5N1病毒。

1.3搖實驗方法

1.3.1搖生物素化抗體搖

將3滋LSulfo鄄NHS鄄Biotin溶液(10mmol/L)和100滋LH5抗體溶液(1.5g/L)加入200滋LPBS緩沖液中,室溫下孵育1h,使生物素偶聯到H5抗體表面。然后用1mL注射器將其注入透析卡內,浸入PBS緩沖液于室溫下透析2h后,更換PBS緩沖液于室溫下繼續透析,經過2h后,更換PBS緩沖液在4益下透析12h,以去除沒有偶聯到抗體上的過量的Sulfo鄄NHS鄄Biotin。最后,將偶聯生物素的抗體溶液從透析卡中移出,用PBS緩沖液將其稀釋1倍,置于4益環境下保存備用。

1.3.2搖免疫磁分離搖

將25滋L表面修飾鏈霉親和素的150nm磁珠、50滋L生物素化的抗體溶液和100滋LPBS緩沖液加入經1%BSA封閉的1.5mL離心管內,置于旋轉混合器中以15r/min的速度旋轉混合,利用生物素與鏈霉親和素之間的高度親和力,將H5抗體連接到150nm磁珠表面。旋轉混合30min后,將離心管置于磁分離器中進行磁分離,移除廢液,即完成了免疫磁珠的制備。在免疫磁珠中加入200滋LPBS緩沖液為對照品,加入200滋L病毒溶液作為待測樣品,于室溫下旋轉混合,樣品中的目標病毒與磁珠表面的抗體發生免疫結合后,采用磁分離器進行磁分離并移除廢液。在對照品和樣品中均加入150滋L測量溶液,經旋渦混合器混合10s后,即可直接進行阻抗測量或于4益下保存備用。

1.3.3搖電極清洗搖

將金叉指陣列微電極置于1mol/LNaOH、1mol/LHCl溶液中分別浸泡5min,然后用蘸有無水乙醇的擦鏡紙輕輕擦拭電極表面,超純水徹底沖洗后用氮氣吹干,即得到表面潔凈的金電極。

1.3.4搖阻抗測量搖

將25滋L對照品或樣品懸液直接滴加到潔凈的叉指陣列微電極表面進行阻抗測量,測量頻率范圍為20Hz~1MHz,外加交流電壓幅值為50mV,記錄Bode阻抗譜(阻抗模值vs頻率)。

2搖結果與討論

2.1搖抗體濃度對阻抗信號的影響

研究了抗體濃度對阻抗信號大小的影響,阻抗信號定義為100kHz頻率下被測樣品與對照品阻抗模值的差值。先將免疫反應時間固定為90min,磁分離時間固定為5min,以濃度為22HAunit/50滋L的純病毒懸液作為被測樣品。分別用0.025,0.05,0.125,0.25和0.5g/L抗體制備免疫磁珠,并進行病毒分離和阻抗測量。由圖2可見,阻抗信號隨抗體濃度增加而增大,當抗體濃度為0.25g/L時,阻抗信號達到最大值。因此,本實驗選擇的最佳抗體濃度為0.25g/L。

2.2搖免疫反應時間對阻抗信號的影響

本實驗研究了免疫反應時間(20,30,50,60,90和120min)對阻抗信號的影響,實驗反應條件為:抗體濃度0.25g/L、磁分離時間5min、純病毒樣品濃度22HAunit/50滋L。結果如圖3所示,隨著免疫反應時間的延長,阻抗信號不斷增大,當免疫反應時間超過60min后,阻抗信號隨反應時間的增加變得緩慢。因此,考慮到盡量縮短測量時間,將免疫反應時間定為60min。

2.3搖磁分離時間對阻抗信號的影響

在不同的磁分離時間(1,2,3,4和5min)下,測定阻抗信號的大小,實驗反應條件為:抗體濃度0.25g/L、免疫反應時間60min、純病毒樣品濃度22HAunit/50滋L。結果表明,阻抗信號隨磁分離時間的延長而增大,3min后達到平衡,阻抗信號值基本保持不變。因此,本實驗確定磁分離時間為3min。

2.4搖禽流感H5N1亞型病毒的檢測

在上述優化的實驗條件下,測量了濃度(2-3~24HAunit/50滋L)純病毒樣品和拭子樣品的阻抗譜,結果如圖4所示。阻抗模值隨H5N1病毒濃度的增加而升高,樣品中AIVH5N1引起阻抗模值的差異在頻率100kHz處最為顯著,因此將100kHz確定為本實驗的特征頻率。在特征頻率下,通過計算樣品與對照品的阻抗差值確定阻抗信號值,在相同條件下將每個濃度的病毒樣品重復制備并測量3次,計算阻抗信號的平均值,其標準差如圖5中誤差棒所示。當純病毒樣品中H5N1病毒濃度在2-1~24HAunit/50滋L范圍內,阻抗信號值(吟Z)與病毒濃度(C)的對數值呈線性關系,線性回歸方程為吟Z=487.8log2C+1243.4(R2=0.9022),檢出限為0.5HAunit/50滋L;當拭子樣品中H5N1病毒濃度在20~24HAunit/50滋L范圍內,阻抗信號值(吟Z)與病毒濃度(C)對數值的線性相關方程為吟Z=388.3log2C+389.8(R2=0.9273),檢出限為2HAunit/50滋L。

2.5搖特異性分析

采用免疫磁分離技術分別制備對照品、濃度為22HAunit/50滋L的AIVH1,H9和ND的純病毒樣品懸液,并測量其在特征頻率下的阻抗模值。非目標病毒AIVH1,H9和ND均不會引起明顯的阻抗變化,此病毒檢測方法具有良好的特異性。

3結論

建立了免疫磁分離和阻抗測量技術檢測禽流感H5亞型病毒的方法,可快速、準確地檢測純病毒樣品和雞的咽拭子樣品中的H5N1病毒。在特征頻率下分析樣品中不同濃度H5N1病毒引起的阻抗變化。對純病毒樣品和拭子樣品進行檢測,檢出限分別為0.5和2HAunit/50滋L。本方法不僅靈敏度高、特異性好,而且操作簡便、檢測速度快,在病原微生物快速檢測領域具有廣泛的應用前景。

作者：顏小飛汪懋華溫新華安冬單位：中國農業大學教育部現代精細農業系統集成研究重點實驗室