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1基因芯片技術(shù)的發(fā)展概況

基因芯片(genechip),又稱DNA芯片,是指將許多特定的寡核苷酸片段或基因片段作為探針,有規(guī)律地排列固定于支持物上,然后與待測的標(biāo)記樣品的基因按堿基配對原理進(jìn)行雜交,再通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進(jìn)行掃描,并配以計算機(jī)系統(tǒng)對每一探針上的熒光信號作出比較和檢測,從而迅速得出所要的信息[1]。近年來該技術(shù)又常被稱作DNA微陣列(DNAmicroarray)或DNA微陣列芯片,也稱為生物芯片(biologicalchiporbiochip),但生物芯片還包括正在研制的蛋白質(zhì)或肽芯片、組織原位芯片等類型。從廣義上講,一切以芯片為基礎(chǔ)的生物分析過程均可稱為生物芯片技術(shù),其中以大規(guī)模DNA雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的芯片技術(shù)尤為人們所矚目。

1.1基因芯片技術(shù)產(chǎn)生的背景過去十余年里,隨著人類基因組計劃(HGP)的逐步實施以及分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科的迅猛發(fā)展,越來越多的動植物、微生物基因組序列得到測定。在GenBank數(shù)據(jù)庫中已含有300萬個序列,總數(shù)超過22億個堿基對,其中包括19種不同生物體的完整序列、近9000個已知功能或已推測功能的人類基因序列。目前基因序列數(shù)據(jù)庫正在以前所未有的速度迅速增長。然而如何充分利用新序列信息資源,怎樣去研究如此眾多基因的生物信息及其在生命過程中所擔(dān)負(fù)的功能,成為生命科學(xué)工作者的共同課題。已建立的諸如North-ern印跡、RNA酶保護(hù)實驗、S1核酸酶分析、噬斑雜交以及狹線印跡等方法不能提供足夠通量來有效地利用新的基因組學(xué)的資源。為此,必須發(fā)展高通量(highthroughout)或平行監(jiān)測基因表達(dá)的新方法。基因芯片技術(shù)正是在這樣的背景下應(yīng)運而生。早在80年代初期,有人就曾設(shè)想利用計算機(jī)半導(dǎo)體技術(shù)生產(chǎn)基因芯片以對人類基因大量的遺傳信息進(jìn)行分析和檢查。但直到1994年P(guān)ease等人創(chuàng)造的光導(dǎo)原位合成(light-directedsynthesis)高密、微化的寡核苷酸陣列(ODTA)的制作技術(shù)問世之后,才使該設(shè)想逐步成為現(xiàn)實。因此可以說光導(dǎo)ODTA化學(xué)合成法,為DNA芯片技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

在DNA芯片獲得突破之后,又建立了通過高速機(jī)器人(high-speedrobotics)將cDNA定位排列到支持物上的cDNA微陣列技術(shù),產(chǎn)生了基因表達(dá)芯片,成為大規(guī)模研究基因功能的強(qiáng)有力手段。1997年Jones建立了“重述DNA測序法”(iterativeDNAsequencingmethod),通過使用Ⅱs類限制性內(nèi)切酶和含有Ⅱs類RE識別區(qū)域的接合器,突破了DNA芯片只能分析單鏈DNA的限制,而可同時對多條雙鏈DNA直接進(jìn)行平行測序。基因芯片的發(fā)展與雙色熒光探針雜交系統(tǒng)(two-colorfluorescentprobehybridization)的建立有密切關(guān)系。將兩個不同樣品的mRNA在反轉(zhuǎn)錄時用不同的熒光底物進(jìn)行標(biāo)記。兩組樣品的cDNA混合后進(jìn)行雜交。對同一個探針位點,在兩組不同的激發(fā)光下進(jìn)行檢測,獲得該位點上兩個不同樣品的雜交信號,其比值經(jīng)陽性對照(外參照)比值和組成型表達(dá)基因(內(nèi)參照)比值的校正后,就是該基因在兩個不同樣品中差異性表達(dá)的比值。這類系統(tǒng)可以很好地克服檢測過程中某些不穩(wěn)定或不確定因素帶來的不利影響,使差異性表達(dá)的研究高效而可靠[2,3]。在此基礎(chǔ)上,近年來各色熒光標(biāo)記底物也已不斷出現(xiàn)。

1.2基因芯片的主要類型基因芯片的類型視分類方法不同可分為不同的類型。

1.2.1無機(jī)片基和有機(jī)合成物片基的基因芯片以基因芯片的片基或支持物(substrateorsupportmatrix)的不同可以分為無機(jī)片基和有機(jī)合成物片基,前者主要有半導(dǎo)體硅片和玻璃片等,其上的探針主要以原位聚合的方法合成;后者主要有特定孔徑的硝酸纖維膜和尼龍膜,其上的探針主要是預(yù)先合成后通過特殊的微量點樣裝置或儀器滴加到片基上。另有以聚丙烯膜支持物用傳統(tǒng)的亞磷酰胺固相法原位合成高密度探針序列。

1.2.2原位合成和預(yù)先合成然后點樣的基因芯片以探針陣列的形式分為原位合成(insitusyn-thesis)與預(yù)先合成然后點樣(off-chipDNAsynthe-sis)兩種。芯片制備的原理是利用照相平板印刷技術(shù)(photolithography)將探針排列的序列即陣列圖“印”到支持物上,在這些陣列點上結(jié)合上專一的化學(xué)基因。原位合成主要是指光引導(dǎo)合成技術(shù),該技術(shù)是照相平板印刷技術(shù)與固相合成技術(shù)、計算機(jī)技術(shù)以及分子生物學(xué)等多學(xué)科相互滲透的結(jié)果。照相平板印刷中可用光引導(dǎo)形成電子線路(electricalcir-cuits),利用類似的原理可在固相支持物上同時合成出大量不同的化合物。預(yù)先合成然后點樣法在多聚物的設(shè)計方面與前者相似,合成工作用傳統(tǒng)的DNA合成儀進(jìn)行。合成后再用特殊的點樣裝置或儀器(如美國的CartesionTechnologies公司的PixSysNQ/PA系列產(chǎn)品)將其以較高密度分布于硝酸纖維膜或經(jīng)過處理的玻片上,點陣密度可達(dá)到3×104spots/cm2。

1.2.3基因表達(dá)芯片和DNA測序芯片根據(jù)芯片的功能可分為基因表達(dá)芯片或基因表達(dá)微陣列(geneexpressionmicroarry)和DNA測序芯片或重述DNA測序芯片(interativeDNAsequencingchip)兩類。前者可以將克隆到的成千上萬個基因特異的探針或其cDN段固定在一塊DNA芯片上,對來源于不同的個體(正常人與患者)、組織、細(xì)胞周期、發(fā)育階段、分化階段、病變、刺激(包括不同誘導(dǎo)、不同治療手段)下的細(xì)胞內(nèi)mRNA或反轉(zhuǎn)錄后產(chǎn)生的cDNA進(jìn)行檢測,從而對這些基因表達(dá)的個體特異性、組織特異性、發(fā)育階段特異性、分化階段特異性、病變特異性、刺激特異性進(jìn)行綜合的分析和判斷,迅速將某個或幾個基因與疾病聯(lián)系起來,極大地加快這些基因功能的確定,同時可進(jìn)一步研究基因與基因間相互作用的關(guān)系。DNA測序芯片則是基于雜交測序(sequencingbyhybridization,SBH)發(fā)展起來的。SBH的原理是,任何線狀的單鏈DNA或RNA序列均可分解成一系列堿基數(shù)固定、錯落而重疊的寡核苷酸,又稱亞序列(subsequence),如由8個核苷酸組成的8體亞序列。

例如,可以把序列TTAGCTCATATG分解為5個錯開一個堿基而重疊7個堿基的8體亞序列(也可分為7體、9體或其他整數(shù)n體的亞序列)。假如我們能把原序列所有這些錯落重疊的8體亞序列全部檢測出來,就可據(jù)此重新組建出原序列。對于一個未知DNA序列,可以用人工合成的、已知序列的所有可能的n體寡核苷酸探針與之雜交(在8體寡核苷酸中,G,C,T,A4者自由組合而成所有可能的序列共有48=65536種)。通過對雜交的檢測,檢出所有能與靶DNA雜交的寡核苷酸,從而獲知靶DNA中的所有8體序列,組合分析后者,即可重構(gòu)靶DNA的序列。如前所述,重述DNA測序法的建立已克服了SBH只能測定單鏈和二級結(jié)構(gòu)對SBH的限制。Affymetrix公司的測序芯片,即是將65536個8nt的寡核苷酸通過光刻的方法在芯片表面原位合成,獲得一個微陣列矩陣,分辨率為50μm。而Chee等則將1.35×105個長度為15nt的寡核苷酸探針固定在芯片上,對長度為16.6kb的整個人線粒體基因組進(jìn)行序列測定,每個檢測位點包括一套4個探針。芯片分辨率為35μm,測序精度為99%。另外也可根據(jù)所用探針的類型不同分為cDNA微陣列(或cDNA微陣列芯片)和寡核苷酸陣列(或芯片),根據(jù)應(yīng)用領(lǐng)域不同而制備的專用芯片如毒理學(xué)芯片(Toxchip)、病毒檢測芯片(如肝炎病毒檢測芯片)、P53基因檢測芯片等。

1.3芯片雜交的檢測方法對于以核酸雜交為原理的檢測的主要過程為:首先用熒光素標(biāo)記經(jīng)擴(kuò)增(也可用其他放大技術(shù))的序列或樣品,然后再與芯片上的探針進(jìn)行雜交后沖洗。圖像的分析用落射熒光顯微鏡(epifluorescencemicroscope),或電荷偶聯(lián)裝置照相機(jī)(charge-coupleddevicecamera)、非共聚焦激光掃描儀(nonconfocallaserscanner)等進(jìn)行。目前應(yīng)用較多的是美國GeneralScanning公司開發(fā)的基因芯片專用檢測系統(tǒng)(ScanArray3000),采用激光共聚焦掃描原理進(jìn)行熒光信號采集,由計算機(jī)處理熒光信號,并對每個點的熒光強(qiáng)度數(shù)字化后進(jìn)行分析。近期又開發(fā)出了ScanArray5000。

2在醫(yī)學(xué)研究中的意義

2.1特異性相關(guān)基因的克隆尋找和鑒定疾病相關(guān)基因是從分子水平上研究疾病,揭示發(fā)病機(jī)制的一項重要基礎(chǔ)性研究工作,利用基因芯片進(jìn)行新基因克隆時,固定在芯片上的探針是某些cDNA文庫內(nèi)的cDN段。研究這些cDN段對應(yīng)基因的差異性表達(dá),就可能選到差異表達(dá)相關(guān)基因。如Schena等通過雙色差示表達(dá)系統(tǒng),研究人T淋巴細(xì)胞在熱休克條件下和佛波酯作用下1046個未知序列的cDNA基因誘導(dǎo)表達(dá)的情況,并對誘導(dǎo)表達(dá)的cDNA進(jìn)行測序,再與已知基因進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn),熱休克誘導(dǎo)了已知的熱休克蛋白基因的表達(dá),其中包括分子伴侶和分子降解的中間體。同樣,佛波酯引起了佛波酯調(diào)節(jié)基因的信號傳導(dǎo)途徑特征基因的表達(dá),如激活細(xì)胞的磷酸酯酶和細(xì)胞因子κB1等。另外,還發(fā)現(xiàn)3個低表達(dá)的已知基因和4個低表達(dá)的新基因可能與該途徑有關(guān)[4]。

2.2基因功能的研究研究基因功能,確定基因與基因間的相互關(guān)系,從而揭示疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制是醫(yī)學(xué)研究的重要內(nèi)容,也是基因表達(dá)芯片最重要的用途之一。Heller等采用基因表達(dá)芯片研究了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、腸炎基因的特征性表達(dá)活性。分別用cyanine3(cyt3)和cyt5對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組織和腸炎粘膜的cDNA進(jìn)行標(biāo)記后,與這兩種疾病發(fā)生過程中目前已知可能起作用的基因陣列進(jìn)行雜交,發(fā)現(xiàn)已知炎癥相關(guān)基因,如腫瘤壞死因子、白介素和粒細(xì)胞集落刺激因子在組織中有表達(dá)。還發(fā)現(xiàn)一些以前未知的與炎癥相關(guān)基因的表達(dá),如人基質(zhì)金屬彈性蛋白酶(humanmatrixmetallo-elastase)和黑素瘤生長刺激因子(melanomagrowthstimulatoryfactor)。同時,與一個來自外周血基因文庫的1046個cDNA克隆的陣列作這兩種病變狀態(tài)基因差異表達(dá)的比較,發(fā)現(xiàn)在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組織中金屬蛋白酶組織抑制物1,鐵蛋白輕鏈和錳超氧化物歧化酶表達(dá)明顯升高[5]。通過該研究,確定了許多基因與這兩種病變的關(guān)系,為治療和發(fā)病機(jī)制的研究提供了新的思路。

2.3基因突變的檢測腫瘤和遺傳疾病發(fā)生的根本原因是由于遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變。檢測基因突變對于闡明腫瘤及遺傳病的分子機(jī)制、疾病的早期診斷具有重要意義。DNA芯片技術(shù)是一項高效、準(zhǔn)確的DNA序列分析技術(shù),將DAN芯片用于檢測分子突變,不僅可準(zhǔn)確地確定突變位點和突變類型,更主要的是它的快速高效是目前所用的其他方法無法比擬的,它可以同時檢測多個基因乃至整個基因組的突變。如Chee等[6]用含有1.35×105個長度為25nt的寡核苷酸探針,分析了16.6kb的人類線粒體基因組DNA(mtDNA),共分析了10個樣本,檢測出了505個多態(tài)性位點,并在Leber′s遺傳性視神經(jīng)疾病患者的mtDNA中檢測出3個致病性突變位點。Hacia等[7]在1.28cm×1.28cm的芯片上固定了9.66×104個長度為20nt的寡核苷酸探針,用于檢測乳腺癌基因BRCA1的exon11(3.45kb)中所有可能的堿基置換、插入和缺失(1～5bp)突變。針對每一個位點,共有28個獨立的探針,14個針對有義鏈,14個針對反義鏈。14個探針包括2個野生型,3個堿基置換、4個插入突變、5個堿基缺失。在15例患者樣品中,發(fā)現(xiàn)有14例有基因突變,類型包括點突變、插入及缺失等;在20例對照樣品中均未檢出假陽性結(jié)果。Cronin等[8]分別用兩種DNA芯片檢測囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)(CFTR)的突變,其中一個芯片包含1480個探針,檢測了CFTR基因的第10和11外顯子的已知突變,包括缺失、插入和單堿基置換,并分析了10個未知樣品的CFTR基因,其結(jié)果與PCR-RELP的分析結(jié)果完全一致。DNA芯片還被用來檢測β-地中海貧血患者的基因突變,并在β-球蛋白研究上檢測出了3個突變位點。

2.4感染病毒的檢測Affymetrix公司開發(fā)了HIV病毒檢測芯片。國內(nèi)博道公司已研制了檢測丙型肝炎病毒(HCV)的基因芯片,他們選取40個HCV基因作為探針制備微陣列,對13個丙型肝炎患者血清和12個正常人血清樣本進(jìn)行檢測,結(jié)果準(zhǔn)確率達(dá)100%。

2.5毒理學(xué)研究Nuwaysir等[9]研制了包括涉及細(xì)胞凋亡、DNA復(fù)制和修復(fù)、氧化應(yīng)激/氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)、過氧化物酶體增殖反應(yīng)、二噁英/多環(huán)芳烴反應(yīng)、雌激素反應(yīng)、看家基因、癌基因和抑癌基因、細(xì)胞周期控制、轉(zhuǎn)錄因子、激酶、磷酸酶、熱休克蛋白、受體、細(xì)胞色素P450等共2090個基因的毒理芯片(ToxChipv1.0),該芯片既可用于毒物的檢測和遺傳多態(tài)性的檢測,又可用于受檢毒物的毒作用機(jī)制的研究。最近,Holden等從人和小鼠文庫中選擇約600個與毒理學(xué)相關(guān)基因的cDNA克隆,制備了種屬特異的毒理基因組學(xué)芯片,可研究肝臟毒性、內(nèi)分泌干擾、致癌作用等毒性終點的作用機(jī)制,也可用于確定以基因表達(dá)模式為基礎(chǔ)的化合物的毒性。

2.6藥物作用機(jī)制的研究基因芯片是研究藥物作用機(jī)制潛在的強(qiáng)有力工具。如有兩項研究分別報道了高密度微陣列芯片在檢測藥物對模式生物酵母基因表達(dá)影響中的應(yīng)用。Gray等[10]報道通過測定藥物使用前后mRNA水平的變化,分析了激酶抑制劑對酵母大規(guī)模基因組的影響。而Marton等[11]報道了免疫抑制藥物FK506的基因表達(dá)模式特征,與此相同的模式在攜帶FK506靶基因無效突變的酵母細(xì)胞中也能觀察到,從而確定了一種基因功能通過遺傳和藥理作用消除后可導(dǎo)致基因表達(dá)的類似變化。Clarke等[12]用基因芯片研究了腸癌患者化療前和治療期間腫瘤基因表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)絲裂霉素C和5-氟尿嘧啶治療均可使糖苷合成酶和尿嘧啶-DNA糖基酶的基因表達(dá)增加。該研究提示,這類研究既有助于闡明藥物的作用機(jī)制,也有助于確定藥物作用的靶基因,為新藥研究提供線索。

3展望

盡管基因芯片發(fā)展時間不長,前幾年又著重于芯片技術(shù)的發(fā)展,迄今在醫(yī)學(xué)研究實際應(yīng)用中的例子還不多,但由于芯片技術(shù)與傳統(tǒng)的雜交技術(shù)相比,有檢測系統(tǒng)微型化,對樣品的需要量非常少,效率高,能同時分析數(shù)千種作為遺傳、基因組研究或診斷用的DNA序列,更好地解釋基因之間表達(dá)的相互關(guān)系及檢測基因表達(dá)變化的靈敏度高等優(yōu)點。基因芯片在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用前景無疑是非常廣闊的,如中西藥物的篩選、疾病的診斷、環(huán)境污染的檢測、基因藥物設(shè)計、疾病發(fā)生和發(fā)展機(jī)制的探討等。1999年NatureGenetics雜志出版了增刊,邀請專家對基因芯片正朝著以下幾方面發(fā)展,一是提高探針陣列的集成度,如有多家公司的芯片陣列的集成度已達(dá)1.0×104左右,這樣基因數(shù)量在1.0×104以下的生物體的基因表達(dá)情況只用一塊芯片即可包括,而人類的基因也可能只需10塊左右芯片就可包括。二是提高檢測的靈敏度,如檢測系統(tǒng)的優(yōu)化組合和采用高靈敏度的熒光標(biāo)志。三是研制新的應(yīng)用芯片,如1999年美國環(huán)保局(EPA)組織專家研討會,討論了毒理學(xué)芯片的發(fā)展策略。四是研制芯片意大利讀器(檢測系統(tǒng))和分析軟件,以充分利用生物信息。五是方法的標(biāo)準(zhǔn)化和降低成本,這是目前推廣應(yīng)用的主要障礙之一。就醫(yī)學(xué)研究而言,從目前來看,選擇什么基因固化探針是一個非常關(guān)鍵的問題,因為這將決定研究成果的重要程度。21世紀(jì)是生命科學(xué)的世紀(jì),也是信息科學(xué)的世紀(jì),作為集兩者之大成的基因芯片,不久的將來可能象PCR儀一樣成為生命科學(xué)研究的工具,其研究和應(yīng)用將會帶動學(xué)科研究的整體進(jìn)步,大大推動生命科學(xué)特別是醫(yī)學(xué)的發(fā)展。