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t淋巴細胞范文第1篇

【關鍵詞】AIDS;相關性;總淋巴細胞;分析

【中圖分類號】R46.62 【文獻標識碼】B【文章編號】1005-0515(2011)08-0011-03

AIDS是由HIV引起的一組綜合征，HIV主要侵犯人CD4+ T淋巴細胞，導致其數量上的減少和功能缺陷，使機體免疫平衡被打破造成免疫功能低下，最終導致各種機會感染和腫瘤。因而，對HIV感染者和AIDS病人定期進行CD4+、CD8+T淋巴細胞 檢測具有十分重要的意義。外周血CD4+T淋巴細胞數是監測HIV+／AIDS患者病情進展、確定抗病毒治療時機和療效評價的重要指標。流式細胞術是檢測CD4+T細胞數的標準方法，該方法所需儀器設備和試劑價格昂貴，對操作人員要求也較高，在醫療資源匱乏的地區和單位難以推廣應用。因此，尋找一種可靠、經濟、簡便的常規檢測指標來替代CD4+T細胞計數，對于HIV+／AIDS的防控有著重大實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料來源:保山市疾病預防控制中心艾滋病、性病防治科病治療數據庫基本信息。

1.2 方法:

從上述資料作統計描述、相關性、試驗的評價、ROC曲線等方面作統計分析研究。

1.3 統計學處理:

統計學處理采用SPSS17.0分析軟件。

2 結果

2.1 對895例A1DS CD4+T淋巴細胞和總淋巴細胞的統計描述，CD4+T淋巴細胞均值134.18±102.48個/ul，直方圖見圖1，總淋巴細胞均值1818.96±3237.57個/ul，直方圖見圖2。

2.2 相關性分析

總樣本數（895）CD4+T淋巴細胞數與TLC的相關系數（r=0.487，P＜0.01）（Spearman相關）；TLC數值在區間（0，1200］時，相關系數為（r=0.421,P＜0.01）；TLC數值在區間（1200，1500］時，不存在相性（P＞0.05）；TLC數值在區間（1500，1800］時，不存在相性（P＞0.05）；TLC數值在區間（1800，7300］時，存在正相關，相關系數為（r=0.092,P＜0.05）。

2.3 篩檢試驗的評價

2.3.1 用TLC數值小于等于1200個/ul預測CD4+T淋巴細胞小于等于100個/ul，靈敏度為62.72%，特異度為82.53%，約登指數（正確指數）為0.45，符合率為73.74%，陽性預測值為74.11%，陰性預測值為73.52%。陽性可能性比值為3.59，陰性可能性比值為2.21。詳見表1。

2.3.2 用TLC數值小于等于1500個/ul預測CD4+T淋巴細胞小于等于200個/ul，靈敏度為64.15%，特異度為67.77%，約登指數為0.32，符合率為65.25%，陽性預測值為81.93%，陰性預測值為45.34%。陽性可能性比值為2.0，陰性可能性比值為1.9。詳見表2。

2.3.3 用TLC數值小于等于1800個/ul預測CD4+T淋巴細胞小于等于300個/ul，靈敏度為69.39%，特異度為51.02%，約登指數為0.21，符合率為68.38%，陽性預測值為96.07%，陰性預測值為8.80%。陽性可能性比值為1.42，陰性可能性比值為1.67。詳見表3。

2.4 ROC曲線:

TCL數值在區間（0，1200］，狀態變量值為15時，ROC曲線下面積最大，面積為0.671，95%置信區間為（0.476，0.865］；ROC曲線見圖3。TCL數值在區間（1200，1500］，狀態變量值為70時，ROC曲線下面積最大，面積為0.720，95%置信區間為（0.411，0.998］；ROC曲線見圖4。TCL數值在區間（1500，1800］，狀態變量值為100時，ROC曲線下面積最大，面積為0.874，95%置信區間為（0，1.0］。ROC曲線見圖5。

3 討論

T淋巴細胞是機體免疫系統內功能最重要的一群細胞。在正常機體內各淋巴細胞亞群相互作用，維持著機體正常免疫功能。當不同淋巴細胞亞群的數量和功能發生異常時，可導致機體免疫功能紊亂并發生一系列病理變化。因此，T淋巴細胞亞群的免疫分型能夠提供有關患者免疫狀態的重要信息。通過對895例原始數據采用Spearman等級相關分析，得出總淋巴細胞與CD4之間在數值上呈正相關性（r=0.487，P＜0.01）。與有關文獻報道相一致，張福杰等的研究也證實HIV+/AIDS患者的CD4+ T細胞計數與總淋巴細胞計數之間存在相關性(r=0．528，P

總淋巴細胞與CD4+T淋巴細胞之間有直線相關,在條件艱苦，醫療資源匱乏的艾滋病高流行區,可以用TLC預測CD+T淋巴細胞水平, 從評價結果看， TLC≤1200個／μl預測CD4≤100個／μl、TLC≤1500個／μl預測CD4≤200個／μl、TLC≤1800個／μl預測CD4≤300個／μl均有較高的靈敏度和特異度。

參考文獻

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t淋巴細胞范文第2篇

【關鍵詞】重癥肌無力;Fas抗原;T淋巴細胞亞群;胸腺切除

The influences of thymectomy on the fas expression and T Cell subsets in peripheral blood lymphocyte from patients with myasthenia gravis

MAI Wei-hua,KOU Li,ZHOU Wen-ying,et al. Department of Neurology,Fifth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,ZhuHai 519000,China

【Abstract】 Objective To investigate the influences of thymectomy on the Fas expression and T cell subsets in peripheral blood lymphocyte(PBL) from patients with myasthenia gravis(MG),so as to make sure whether Fas-mediated apoptosis is involved in the mechanism of thymectomy in MG therapy.Methods We analyzed CD4、CD8 and Fas expressions in PBL from 17 patients with MG and 13 healthy controls using flow cytometric analysis.Results The percentage of CD4-CD8+cells in PBL of MG patients without thymectomy was significant higher,while the percentage of CD4-CD8-cells was significant lower,compared with controls(P

【Key words】Myasthenia gravis;Fas antigen;T cell subsets;Thymectomy

DOI:10.3760/cma.j.issn 1673-8799.2010.06.16

作者單位:519000中山大學附屬第五醫院神經內科

重癥肌無力(myasthenia gravis.MG)是一種神經-肌肉接頭傳遞功能障礙的獲得性自身免疫性疾病,主要累及突觸后膜上的乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor,AchR),由抗乙酰膽堿受體抗體(AchRAb)介導。然而,MG確切的發病機制迄今尚未清楚。胸腺與MG的發病密切相關。10%~15%的MG患者伴有胸腺瘤,50%~60%伴有胸腺增生[1]。胸腺切除術治療MG可獲得良好療效[2]。Fas/CD95是一細胞表面分子,屬于腫瘤壞死因子家族成員。Fas通過與其配體FasL結合誘導細胞凋亡。Fas/FasL對于調節自身抗原反應性T淋巴細胞的克隆清除,維持機體內免疫功能狀態的穩定,防止自身免疫性疾病的發生具有重要意義。關于Fas/FasL與MG的關系目前國內外報道尚少。本實驗通過流式細胞技術檢測MG患者外周血淋巴細胞(peripheral blood lymphocyte,PBL)表面CD4、CD8及Fas的表達,研究胸腺切除術對MG患者PBL中Fas表達及T淋巴細胞亞群的影響,探討胸腺切除術治療MG與Fas/FasL介導的細胞凋亡的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象 MG患者組17例,為2007年10月至2009年12月我院神經內科住院及門診患者,根據典型臨床表現、新斯的明試驗及部分患者神經重復電刺激檢查確診。其中男6例,女11 例,年齡22~76歲,平均(46.47±14.35)歲,病程8個月~20年,平均(6.43±5.15)年。Osserman分型:I型4例(23.5%),IIA型4例(23.5%),IIB型6例(35.3%),IV型3例(17.6%)。其中11例患者行胸腺切除術治療,術后病理:胸腺增生7例(63.6%),胸腺瘤2例(18.2%),胸腺脂肪瘤1例(9.1%),胸腺多房囊腫1例(9.1%)。所有患者均不伴有感染性疾病及其他免疫性疾病,采血前3個月內未接受過免疫抑制劑治療。正常對照組13例,為健康自愿獻血者,男4例,女9例,平均年齡(40.23±11.05)歲。本研究得到中山大學附屬第五醫院倫理委員會批準,取得了受試對象的知情同意。

1.2 主要試劑 藻紅蛋白標記小鼠抗人Fas/CD95單克隆抗體(Fas/CD95-PE)、多甲藻黃素葉綠素蛋白標記小鼠抗人CD4單克隆抗體(CD4-PerCP)、異硫氰酸熒光素標記小鼠抗人CD8單克隆抗體(CD8-FITC)、同種型熒光染色免疫球蛋白(小鼠抗人IgG1-PE、IgG1-PerCP、IgG1-FITC),均為美國Becton Dickinson公司產品,購自廣州流式生物科技有限公司。

1.3 流式細胞術(Flow cytometry analysis) 取MG患者及對照組新鮮肝素鈉抗凝血100 ul,加入3種小鼠抗人熒光素標記的單克隆抗體Fas/CD95-PE、CD4-PerCP、CD8-FITC各20 ul,混勻后室溫避光孵育15~20 min。加入100 ul溶血素(BD Bioscience,USA)混勻,室溫避光靜置10 min,離心10 min(1000 r//min)后去上清。PBS洗滌2次后,加入1%多聚甲醛適量固定細胞,避光放置10 min,以同種型熒光染色免疫球蛋白(小鼠抗人IgG1-PE,IgG1-PerCP,IgG1-FITC)作為陰性對照,用FACScan型流式細胞儀(Becton Dickinson,USA)進行檢測,使用Cell Quest軟件分析PBL表面CD4、CD8及Fas抗原的表達。

1.4 統計學方法 使用SPSS 16.0軟件。正態性檢驗采用one sample Kolmogorov-Smirnov test,正態分布計量資料用均數±標準差(x±s)描述,組間差異比較采用one-way ANOVA方差分析,多組均數比較采用SNK及LSD法,雙側檢驗水準α=0.05。P

2 結果

2.1 MG患者與對照組PBL表面CD4、CD8分子的表達 與對照組相比,無行胸腺切除術組MG患者PBL中CD4-CD8+細胞比例升高,CD4-CD8-細胞比例下降,差異有統計學意義(P=0.028及0.047);行胸腺切除術組CD4-CD8+細胞比例較無行胸腺切除術組下降,差異有統計學意義(P=0.019)。結果見表1。

表1

MG患者與對照組外周血淋巴細胞表面CD4、CD8分子的表達(x±s,%)

組別例數CD4+CD8-CD4-CD8+CD4+CD8+CD4-CD8-CD4+/CD8+

無行胸腺切除術MG患者630.372±6.49036.733±11.5840.392±0.19232.422±12.0930.928±0.421

行胸腺切除術MG患者1136.070±7.85325.248±7.6200.576±0.51238.108±7.1061.651±0.962

對照組1330.285±6.63526.311±8.9990.448±0.33342.957±11.5451.292±0.510

三組比較P值0.1200.044*0.5990.1250.137

F值2.3003.5090.5232.2462.143

兩兩比較P值 P10.1250.019*0.3630.2840.052

P20.9800.028*0.7740.047*0.302

P30.0560.7770.4330.2580.222

注:P1為無行胸腺切除術MG組與行胸腺切除術MG組比較P值;P2為無行胸腺切除術MG組與對照組比較P值;P3為行胸腺切除術MG組與對照組比較P值。*P

2.2 MG患者與對照組PBL表面Fas抗原的表達 無行胸腺切除術組MG患者PBL中Fas+、CD8+Fas+細胞比例以及行胸腺切除術組Fas+細胞比例均高于對照組,差異有統計學意義(P0.05)。結果見表2。

表2

MG患者與對照組外周血淋巴細胞表面Fas抗原的表達(x±s,%)

組別例數Fas+CD4+Fas+CD8+Fas+

無行胸腺切除術MG患者644.792±6.14566.163±12.45861.140±11.818

行胸腺切除術MG患者1139.962±8.12263.424±9.98751.776±9.840

對照組1331.219±12.99955.179±10.84945.590±11.497

三組比較P值0.026*0.0800.026*

F值4.1992.7724.167

兩兩比較P值 P10.3650.6230.104

P20.013*0.0500.008*

P30.048*0.0750.180

注:P1為無行胸腺切除術MG組與行胸腺切除術MG組比較P值;P2為無行胸腺切除術MG組與對照組比較P值;P3為行胸腺切除術MG組與對照組比較P值。*P

3 討論

Fas/FasL是介導細胞凋亡的主要途徑之一。許多自身免疫性疾病存在自身反應性淋巴細胞清除障礙,尤其是外周,與Fas介導的細胞凋亡缺陷有關[3]。MG屬于器官特異性自身免疫性疾病,胸腺與MG的發病密切相關。胸腺可能是MG患者自身免疫反應的始動及維持部位。胸腺切除術后,MG患者體內抗AchR抗體滴度下降[4]。然而,胸腺切除術治療MG與Fas/FasL介導的細胞凋亡的關系迄今尚未明確。

Masunaga等[5]報道Fas抗原及Fas mRNA在MG患者胸腺細胞中表達均下降。Utsugisawa等[6]則發現Fas mRNA在MG患者胸腺細胞中的表達不下降,反而升高。Moulian等[7]報道抗AChR抗體陽性的MG患者Fas高表達的胸腺細胞比例升高。MG患者胸腺瘤中Fas的表達顯著高于正常胸腺組織[8]。另有報道MG患者CD4+CD8+胸腺細胞Fas表達降低,CD4-CD8+胸腺細胞Fas表達升高[9]。上述研究提示MG患者胸腺細胞存在Fas表達異常。本實驗通過研究胸腺切除術對MG患者PBL中Fas表達及T淋巴細胞亞群的影響,探討胸腺切除術治療MG與Fas/FasL介導的細胞凋亡的關系。

關于MG患者外周血T淋巴細胞亞群的研究目前結果不一,有報道MG患者外周血單個核細胞CD4+CD8-細胞比例下降[10];另有報道外周血CD8+T淋巴細胞百分率下降,CD4+/CD8+比值升高[11]。本實驗結果示,無行胸腺切除術組MG患者PBL中CD4-CD8+細胞比例升高,CD4-CD8-細胞比例下降。與無行胸腺切除術組對比,行胸腺切除術組CD4-CD8+細胞比例下降,差異有統計學意義;CD4+CD8+細胞比例及CD4+/CD8+比值升高,但差異無統計學意義。本實驗結果表明MG患者存在外周血T淋巴細胞亞群分布異常,胸腺切除術對外周血T淋巴細胞亞群分布具有影響。

國內有學者發現MG患者外周血單個核細胞中Fas+、CD4+Fas+細胞比例低于對照組,提示MG患者外周血淋巴細胞可能存在活化誘導的細胞凋亡障礙,活化的淋巴細胞不能通過Fas途徑凋亡,從而引起過強的免疫應答,導致自身免疫性疾病的發生[10]。Moulian等[7]報道MG患者胸腺細胞Fas的高表達在外周未被中和,外周血淋巴細胞Fas的表達仍升高。本實驗結果示,無行胸腺切除術組MG患者PBL中Fas+及CD8+Fas+細胞比例高于對照組,行胸腺切除術組MG患者PBL中Fas+細胞比例高于對照組,與Moulian的報道一致。已有研究表明系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)患者外周血淋巴細胞Fas的表達升高,并認為其反映了體內T淋巴細胞的活化[12,13],因為SLE患者外周血T淋巴細胞活化標記物CD25[14]、MHC-II分子[15]的表達增加,且幼稚T淋巴細胞在體外經促有絲分裂刺激后可誘導Fas產生[15]。此外,有報道FasL參與不依賴Ca2+的T細胞介導的細胞毒性作用[17],SLE患者CD8+T淋巴細胞Fas表達的增高還可能與FasL的表達相關,從而促進Fas+CD8+T淋巴細胞介導的組織損傷[12]。本實驗結果示MG患者PBL中Fas+及CD8+Fas+細胞比例高于對照組,推測可能反映了MG患者體內T淋巴細胞的活化及Fas+CD8+T淋巴細胞介導的細胞毒性作用增強,與MG的發病機制有關。本實驗結果還顯示,行胸腺切除術組MG患者外周血Fas+、CD4+Fas+及CD8+Fas+細胞比例均低于無行胸腺切除術組,雖然差異無統計學意義,仍提示胸腺切除可能通過降低PBL中Fas的表達,減少體內T淋巴細胞的活化及Fas+CD8+T淋巴細胞介導的細胞毒性作用,達到治療MG的目的。加大樣本量深入研究有助于進一步明確胸腺切除術治療MG與Fas/FasL介導的細胞凋亡的關系。

參考文獻

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t淋巴細胞范文第3篇

關鍵詞：間充質干細胞；T淋巴細胞；免疫調節

Immune Regulation of Mesenchymal Stem Cells on T Lymphocytes

WANG Hui-ge，GAO Jian-peng

（Department of Gastroenterology，The Affiliated Yanan Hospital of Kunming Medical University，Kunming 650015，Yunnan，China）

Abstract：Mesenchymal stem cells have the biological characteristics involving strong proliferation capability，widely distribution and low immunogenicity，which are used in the treatment of the immune diseases.A growing number of studies have found that T lymphocytes play a significant role in the development and progression of autoimmune disease.And MSCs can influence the activation，proliferation and the proportion of subsets of T lymphocytes through the cell-cell contact，cytokine，then achieve the goal of immune regulation，relieve illness.The review summarizes that the immune effect of MSCs on T lymphocytes.

Key words：Mesenchymal stem cells；T lymphocytes；Immune regulation

相關研究證明，T淋巴細胞的異常表達和缺失可導致自身免疫性疾病的發生，而間充質干細胞具有多項分化潛能及免疫調節功能，可通過細胞間的直接接觸或（和）通過產生可溶性因子對調節性T細胞進行調控，從而控制自身免疫性疾病的發生和發展。

1 間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）

間充質干細胞僅表達中等量水平MHC-I類分子，不表達MHC-II分子和Fasl配體和B7-1、B7-2、CD40、CD40L等共刺激分子。而T淋巴細胞的激活所需的共刺激分子缺如，使T細胞活化的第二信號喪失，導致Th細胞的無反應性而促成免疫耐受，因此MSCs表現出耐受原性和低免疫原性。

2 T淋巴細胞

T細胞具有高度的異質性，根據其表面標志和功能特征，T細胞可分為不同的亞型，各亞群之間相互調節，共同發揮免疫學功能。

2.1 CD4+T細胞和CD8+T細胞的亞群、分化及功能

2.1.1 CD4+T細胞的亞群、分化及功能 Th1細胞分泌IFN-γ、TNF、IL-2、IL-3等；Th2細胞分泌IL-3、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等；Th3細胞分泌大量TGF-β。這些細胞因子不僅每個亞群的免疫效應功能，還調控各亞群的形成和擴增。

2.1.2 CD8+T細胞的功能 CD8+T細胞受自身MHC-I類分子的限制，活化后分化為細胞毒性T細胞（CTL），其可通過分泌穿孔素、顆粒酶、淋巴毒素及表達FasL引起靶細胞裂解和凋亡。

2.2 T細胞的活化 T細胞的完全活化有賴于雙信號和細胞因子的作用。T細胞活化的雙信號：第一信號即抗原提呈細胞（antigen-presenting cell，APC）將pMHC提成給T細胞，T細胞受體（T cell receptor，TCR）特異性識別結合在MHC分子槽中的抗原肽，啟動抗原識別信號（即T細胞對抗原的識別）；第二信號即T細胞與APC細胞表面多對協同刺激分子相互作用產生T細胞活化。活化的APC和T細胞可分泌IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和IFN-γ等多種細胞因子，他們在T細胞激活中發揮重要作用。

3 MSCs對T細胞的作用

3.1不同來源的MSCs對T細胞的作用具有相似性。有學者研究進行研究，發現骨髓來源和脂肪來源的MSCs同樣具有抑制T細胞增殖的能力；同時研究者對來源于臍帶血和骨髓的MSCs進行分析，發現兩種來源的MSCs均具有抑制植物血凝素誘導淋巴細胞增殖的作用。故而可認為不同來源的MSCs對T淋巴細胞的作用具有相似性。

3.2 MSCs可以抑制T淋巴細胞增殖，并改變其亞群比例。MSCs可以通過分泌細胞因子和影響樹突細胞（DC）的作用抑制T淋巴細胞的增殖，并改變其亞群比例。張偉等研究發現MSCs能分泌高水平的TGF-β1，且MSCs的上清抑制PHA刺激的T淋巴細胞的增殖，抑制PHA活化的T淋巴細胞IFN-γ的分泌。陳健琳研究小組也發現MSCs高表達TGF-β1基因，但不表達IL-4和IFN-γ基因，ELISA證實MSC培養上清存在TGF-β1蛋白。

4 小結和展望

MSCs可對T淋巴細胞的增殖、活化、亞群比例進行調節，但不同組織來源的MSCs對T淋巴細胞的抑制效果不同的，且MSCs對T淋巴細胞的調節具有濃度依賴性，故而還需大量的實驗證據對MSCs作用T淋巴細胞的濃度提供依據，并完善MSCs對T細胞的作用途徑的描述。

參考文獻：

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t淋巴細胞范文第4篇

[關鍵詞]脂多糖；哮喘小鼠；T細胞；白介素-17

[中圖分類號] R-332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）01（c）-0120-03

[Abstract]Objective To explore the influence of LPS with low dosage on the secretion of IL-17 and the potential mechanism.Methods The asthma mouse model was copied successfully and the T cells from spleen were isolated and cultured in vitro，and the mice were divided into the control group and the LPS group.The mice in LPS group were divided into the LPS group 1 and the LPS group 2，and were stimulated with 1，2 ng/ml LPS respectively for 72 hours.The control group was stimulated with the same volume of saline.The concentrations of IL-17 in the supernatant were detected with ELISA，the change of concentration of IL-17 was observed.Results After stimulation with lower dosages of LPS，the secretion of IL-17 in the supernatant decreased significantly in the LPS groups than that in the control group，with significant difference （P

[Key words]Lipopolysaccharide；Asthma mice；T cell；Interleukin-17

支夤芟喘是全球常見的慢性疾病之一，是由T細胞、B細胞、嗜酸粒細胞、肥大細胞等多種炎癥細胞和細胞因子參與的慢性氣道炎癥性疾病[1-2]。T細胞及其亞群如Th2細胞分泌的細胞因子如白介素-4（interleukin-4，IL-4）、IL-5、IL-13、IL-17等直接參與了哮喘的炎癥過程，進而誘發哮喘的一系列癥狀[3]。IL-17是一種主要由CD4+T淋巴細胞、嗜酸粒細胞等分泌的前炎性細胞因子，具有強大的募集中性粒細胞及促進多種炎性因子釋放的作用，參與了機體多種炎癥性疾病的發生、發展[4-5]，在哮喘的慢性氣道炎癥過程中，也發揮著重要的作用[6]。本實驗利用低劑量脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）在體外刺激哮喘小鼠T細胞，檢測其IL-17的產生情況，探討低劑量LPS誘導IL-17的產生及哮喘T淋巴細胞免疫耐受的可能機制。

1材料與方法

1.1主要試劑及儀器

RPMI 1640培養基、胎牛血清（Hyclone公司），Al（OH）3（A8222，Sigma公司），雞卵清蛋白（A5503，Sigma公司），尼龍毛柱（Cat.146-04231，日本Wako公司），小鼠紅細胞裂解液（碧云天公司），小鼠IL-17 ELISA試劑盒（Diaclone公司），倒置顯微鏡（日本Nikon），Eppendorf離心機，流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司），霧化器（boyo37G6000型，德國百瑞公司），空氣壓縮泵（德國百瑞公司）。

1.2實驗動物與分組

BALB/c小鼠15只，清潔級，4～6周齡，體重20～30 g，雌雄不限，隨機分為兩組，對照組5只，LPS組10只，其中LPS組又分為LPS1組和LPS2組，各5只。小鼠購自溫州醫學院實驗動物中心，在普通清潔條件下飼養，自由取水、攝食。

1.3哮喘小鼠模型的制作

10只LPS組小鼠分別于第1、14天致敏，即經小鼠腹腔注射OVA 10 μg與Al（OH）3凝膠20 mg的混合液，總體積200 μl；第25天開始，將小鼠放置于容積為5 L的密閉容器中，通過連接霧化吸入器的空氣壓縮泵，以3%的OVA氣溶膠激發小鼠，30 min/次，1次/d，總共3次。5只正常對照組小鼠以等量的生理鹽水代替OVA致敏及激發。最后1次激發后48 h處死小鼠，收集標本。

1.4 T細胞的體外分離培養

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t淋巴細胞范文第5篇

作者：彭磊　王臻　王慶良　王鵬飛　胡蘊玉　吳銀松

【關鍵詞】 骨肉瘤

關鍵詞: 骨肉瘤;T淋巴細胞，細胞毒性;體外擴增

摘 要:目的 研究骨肉瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞（CTL）體外擴增培養的方法，并進行細胞毒檢測. 方法 抽取骨肉瘤患者自身的外周血，分離淋巴細胞，用IL-2體外短期刺激方法提高對骨肉瘤細胞的免疫性，再按一定比例體外與多西紫杉醇處理的骨肉瘤細胞及巨噬細胞混合培養（MTLC）可獲得骨肉瘤的特異性CTL細胞，進行鑒定并觀察其殺傷特性. 結果 混合培養4d后，即可擴增出大量淋巴細胞，流式細胞儀證實主要是CD8+ 細胞，這些具有殺傷活性的CTL細胞體外對自身腫瘤細胞有很強的細胞毒作用. 結論 在IL-2作用下，應用巨噬細胞、自體腫瘤細胞及淋巴細胞體外混合培養，是體外擴增特異性細胞毒性T淋巴細胞的較好方法，CTL作為新的特異性免疫治療方法有望提高骨肉瘤的免疫治療效果.

Keywords:osteosarcoma;CTL;proliferation in vitro

Abstract:AIM To induce the osteosarcoma specific CTL proliferation in vitro.METHODS We isolated T lympho-cytes from peripheral blood of osteosarcoma cases，which were previously dealt with docitaxol，and activated with com-bination of macrophages and interleukin-2（IL-2），then their tumor-killing ability was measured.RESULTS A large number of lymphocytes that proliferated after3d mixed cul-com ture were proved mainly to be CD8+ T cell by FCM，and their tumor-killing ability was great in vitro.CONCLUSION The specific CTL proliferation in vitro by mixed culture of macrophages，host tumor cells and lymphocytes under the presence of IL-2is a prospective way in the immunological therapy of tumor.It may improve the therapeutic effect of osteosarcoma.

0 引言

免疫治療是惡性腫瘤治療的重要輔助方法，已確認機體免疫監視功能中起重要作用的是細胞免疫，其中起特異性殺傷作用的是細胞毒T淋巴細胞（CTL），CTL具有特異性高、殺傷性強等特點，故有重要的臨床應用前景，成為新的研究熱點，但此研究在骨惡性腫瘤尚屬起步階段.我們應用自建系的骨肉瘤細胞系PL-992與患者自身淋巴細胞及巨噬細胞體外混合培養（MTLC），擴增出大量淋巴細胞，并對這些淋巴細胞進行生物學特性測定.

1 材料和方法

1.1 骨肉瘤細胞系PL991來源及預處理 手術無菌切除新鮮活力好的骨肉瘤組織，病理診斷為骨肉瘤骨母細胞型，接種裸鼠皮下，待腫瘤長出后，組織塊培養法，體外傳代建系并進行生物學特性測定.用6mg L-1 多西紫杉醇處理48h后與淋巴細胞體外混合培養.

1.2 自體淋巴細胞的分離 抽取骨肉瘤患者外周血4mL，淋巴細胞分離液（購于Sigma公司）1500g離心15min，分離淋巴細胞（1×106 ），培養于200mL L-1 小牛血清RPMI1640的完全培養液中.

1.3 特異性殺傷性T淋巴細胞的體外刺激誘導 用班蟊液獲得患者自體的巨噬細胞加入用IL-2（上海華新生物高技術公司）150U mL-1 ，植物血凝素預刺激36h的淋巴細胞，同時加入1/8的多西紫杉醇處理的骨肉瘤細胞PL-991，37℃50mL L-1 CO2 條件下培養，細胞計數，并在倒置顯微鏡下觀察.

1.4 流式細胞儀增殖T淋巴細胞檢測 取2×106 mL-1 待測細胞加入U型孔內，再加入CD3+ CD4+ CD8+ 單抗，每孔各20μg，4℃孵育30min，應用免疫熒光和流式細胞儀測定淋巴細胞CD3+ +CD4+ +CD8+ 表型.

1.5 細胞毒活性檢測 采用51 Cr釋放法，取對數生長期的PL-992骨肉瘤細胞為靶細胞，密度為107 mL-1 ，加入（51 Cr）Na2 CrO3 70kBq mL-1 ，37℃孵育1h，PBS洗滌2遍后，按104 /孔加入96孔板，按不同的效靶比加入T細胞，培育4h后收集上清液作γ計數，自然釋放孔為僅加入靶細胞，最大釋放孔為靶細胞加入100μL NP40.

細胞毒計算公式為:細胞毒活性=（實驗孔CMP-自然孔CMP）/（最大釋放孔CMP-自然孔CMP）×100%.實驗孔均設三復孔.

2 結果

2.1 形態學觀察 應用倒置顯微鏡觀察，細胞體積明顯變大，共孵后體積增大2～3倍，呈圓形、多邊形、新月形、三角形等多種不規則形態，以腫瘤細胞為中心，形成特異性淋巴細胞增值克隆，在倒置顯微鏡下呈葡萄狀排列，并且細胞數量逐漸增多，4d后細胞串開始脫落，腫瘤細胞已經發生凋亡（Fig1）.

圖1 誘導前后CTL細胞形態，誘導后細胞多樣并可見腫瘤細胞的凋亡　略

2.2 細胞生長曲線 淋巴細胞加入腫瘤細胞后生長迅速，繼而細胞數量迅速增加由1.6×106 增至第5日1.5×107 （Fig2）.

圖2 CTL細胞增殖迅速　略

2.3 流式細胞儀測定 淋巴細胞CD4+ （17.0±1.1）%，CD8+ 占（76.0±5.3）%，CD3+ 占（84.0±2.4）%，CD8+ CD3+ 占（67.0±2.1）%證實為特異性淋巴細胞為主.

2.4 特異性殺傷性T淋巴細胞細胞毒活性 誘導出的CTL對自體骨肉瘤細胞的細胞毒活性，培養誘導的細胞毒性T淋巴細胞對自體骨肉瘤細胞的殺傷活性為84.3%與未誘導的T淋巴細胞有顯著性差異（P

3 討論

體外誘導腫瘤特異性CTL并作為新的過繼性免疫治療的活性細胞已成為近年來腫瘤治療研究中的一個新的熱點，特別是由CTL篩選腫瘤的特異性抗原作為腫瘤疫苗有廣闊的應用前景，與黑色素瘤等免疫原性腫瘤不同，骨肉瘤的特異性抗原至今仍難定義［1］ ，因此設想直接用處理的腫瘤細胞刺激誘導CTL較為困難，但是國外有應用樹突狀細胞刺激誘導出腫瘤特異性CTL細胞的研究基礎，巨噬細胞也同屬于腫瘤抗原提呈細胞，對腫瘤抗原有一定的提呈功能.另外，活化巨噬細胞分泌多種因子，有利于淋巴細胞識別腫瘤抗原，MHC I，II抗原表達增強，膜表面TNF IL-1，IL-7表達增強［2，3］ .體內實驗也證明，殺傷腫瘤細胞時巨噬細胞的浸潤要早于T淋巴細胞，在腫瘤原位也找不到活化跡象，在引流淋巴結處T細胞有明顯的活化，增殖巨噬細胞處理抗原，提呈抗原，導致腫瘤特異性T細胞活化［4-6］ .因此，我們采用巨噬細胞，處理的腫瘤細胞以及淋巴細胞體外混合培養，借助這兩方面的理論基礎，設想在體外模擬T細胞特異性激活的過程，誘導特異性的CTL.我們發現，應用巨噬細胞體外刺激淋巴細胞，T淋巴細胞體外擴增的速度明顯快于既往作者的擴增速度，巨噬細胞提取方法簡便宜行，使用價值較大［7-9］ .另外，我們還發現共孵后巨噬細胞的吞噬功能明顯增強（另文報道），說明體內巨噬細胞與淋巴細胞有協同作用.

圖3 略

總之，巨噬細胞與淋巴細胞共培養是一種較好的體外擴增特異性T淋巴細胞的方法，對于研究體內特異性淋巴細胞的轉歸及機制有重要價值，同時也說明了骨肉瘤的抗原性較強，腫瘤特異性淋巴細胞體外 回輸的方法具有殺傷性強，特異性高等特點，有望提高骨肉瘤免疫治療的結果，故有著重要的臨床應用前景，值得深入研究.

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