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nk細胞范文第1篇

異基因造血干細胞移植后，供者細胞可產生強大而持久的免疫治療功效，其中異源反應性nk細胞活性是T細胞異源反應活性以外的，具有顯著抗腫瘤/白血病活性的自然免疫現象，并逐漸受到人們的重視。已證實，NK細胞通過其受體與靶細胞MHC分子特異性的識別機制參與移植物抗白血病（GVL）作用并影響移植物抗宿主病（GVHD）的發生。異基因造血干細胞移植后異源反應性NK細胞輸注已從動物實驗逐漸應用于臨床。本文就NK細胞異源反應性及其在異基因造血干細胞移植中的作用進行綜述。

【關鍵詞】 異基因造血干細胞移植；NK細胞；移植物抗白血病；移植物抗宿主病

Role of NK Cells in Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplantation ——Review

Abstract

After allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT)，the donor cells present a profound immunization therapy efficiency. Among these effector cells，allo-reactivity natural killer (NK) cell activation are concerned with the graft-versus-host disease (GVHD) and graft-versus-leukemia (GVL) effect . As known，GVHD is primarily a T-cell-mediated event but not initiated by NK cells. NK cells may significantly enhance GVL immune response by using an integration of activating and inhibitory receptors. Allo-reactivitive NK cell infusion after allo-HSCT already transits from experiments to clinic. In this review the background on NK cells，and their clinical roles in Allo-HSCT were summarized.

Key words

allogeneic hematopoietic stem cell transplantation; natural killer cell; graft-versus-leukemia; graft-versus-host disease

異基因造血干細胞移植(allo-HSCT)是治療多種惡性病及一些非惡性病的有效方法，尤其在治療急性白血病方面，可使50%患者長期無病生存。研究發現，異基因造血干細胞移植后，供者免疫系統在受者體內的重建可產生移植物抗白血病（graft versus leukemia，GVL）作用，但也產生危及患者生命的移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）及遲發的免疫功能障礙。隨著對NK細胞功能及活化機制的了解，其在allo-HSCT后造血重建及免疫重建中的作用越來越受到重視。許多的動物實驗和臨床觀察均提示allo-HSCT后，供者NK細胞的異源反應活性通過促進植入、阻止T細胞介導的GVHD、攻擊宿主白血病細胞發揮GVL效應。上述現象最初發現于單倍不相合移植，而后研究提示在HLA相合有血緣關系及非血緣關系供者移植中均有體現［1，2］。但最近國外也有研究發現，KIR-配體不相合引起的NK細胞異源反應性與移植相關死亡率（transplantation related mortality，TRM）升高及總存活率下降有關［3，4］，故在這方面的研究仍是熱點，存在許多爭議。本文就NK細胞異源反應性的形成機制、NK細胞在allo-HSCT中的作用等問題的研究新進展綜述如下。

NK細胞群

NK細胞及來源

NK細胞是淋巴細胞譜系中不同于T、B淋巴細胞的一類大顆粒淋巴細胞，其代表性表型為CD3-、CD56+、CD16+。它是天然免疫系統的主要效應細胞，無需抗原預先致敏，與靶細胞混合后4小時內即可發揮殺傷作用，表現為速發效應，因此位于機體抵御腫瘤和病毒感染的第一道防線，同時又能通過早期分泌多種細胞因子和趨化因子來調節獲得性免疫，故也是連接天然免疫與獲得性免疫的橋梁［5，6］，在機體免疫調節、造血調控、抗腫瘤和抗感染等方面發揮著重要的作用。Cooper等［7］根據NK細胞上CD56分子表達密度的不同將NK細胞分為CD56bright和CD56dim兩個亞群，在正常人外周血單個核細胞主要參與NK細胞細胞毒作用。NK細胞來源于骨髓CD34+造血干細胞，其發育、成熟需要骨髓微環境包括骨髓基質及其來源的細胞因子。NK細胞與T細胞來自同一祖細胞，這種分化上的親緣性可能解釋了NK細胞活化也受協同刺激信號的影響，及胞內信號傳導通路與T細胞極為相似等現象。但與T細胞不同，NK細胞的發育成熟不依賴于胸腺，在骨髓微環境中，IL15與其配體C-kit（KL）和flt-3（FL）的協同作用是NK細胞發育的關鍵生理調節因素，在其最初發育期，NK祖細胞在早期基質細胞活化生長因子KL、FL作用下發育為NK細胞前體，該前體細胞在IL-15作用下發育成熟為功能性NK細胞。

NK細胞受體及殺傷活性調節

NK細胞功能的發揮主要依賴于其識別靶細胞的受體。它有兩種受體：一類是激發NK細胞殺傷作用的殺傷細胞活化受體（killer activatory receptor，KAR），如CD94/NKG2C、NKP-P1、KIR-3Dshort；另一類是抑制NK細胞殺傷作用的殺傷細胞抑制受體（killer inhibitory receptor，KIR），如CD94/NKG2A、KIR-3Dlong。按分子結構，也可將與NK細胞殺傷作用相關的受體分為免疫球蛋白樣受體（immunoglobulin-like receptor）和凝集素樣受體(lectin-like receptor)。一般認為，NK細胞可同時表達活化和抑制受體，其殺傷功能取決于表面抑制性受體與活化受體所傳遞信號的綜合。抑制性受體KIR的配體為MHC-Ⅰ類分子。由于抑制性受體與其配體結合的親和力大于活化受體，因此通常以抑制性信號占優勢。正常情況下，機體組織細胞表面表達自身MHC-Ⅰ類分子，NK細胞KIR識別自身MHC-Ⅰ類分子，產生殺傷抑制信號，該信號在胞內起主導作用，能阻斷殺傷信號的傳遞，表現為自身組織細胞不被破壞。只有當靶細胞表面MHC-Ⅰ類分子表達降低、丟失或發生變異（如細胞發生惡性轉化、病毒感染等）時，NK細胞才能活化并啟動殺傷作用，此即NK細胞的丟失自我（missing self）識別模式，即“殺傷自身MHC抗原減少或消失的細胞”［8］。

異基因造血干細胞移植中的NK細胞作用

NK細胞的“有利作用”

在異基因造血干細胞移植中，根據上述“丟失自我機制”，大部分情況下供者NK細胞KIR與受者靶細胞MHC分子的特異性識別表現為KIR-配體不相合性（少數情況下供受者KIR基因可能相合），可激活供者NK細胞，產生異源反應性NK細胞。KIR-配體不相容性與供者NK細胞的異源反應性密切相關。研究證實，此機制已參與移植物的植入、GVL作用及GVHD的發生，并對異基因造血干細胞移植產生有利影響，現分述如下。

NK 細胞與移植物的植入

無論供者、受者NK細胞都對移植物的植入有一定影響。受者方面，盡管在鼠類的研究顯示了抗放射性宿主NK細胞在抵抗骨髓植入中的重要性，但臨床干細胞移植中宿主NK細胞介導的抗植入現象卻很有限。移植前抑制受者免疫的強化處理方案及大量植入的干細胞數量可基本抵消受者NK細胞的抗植入作用。供者方面，越來越多的研究發現，allo-HSCT過程中供者異源反應性NK細胞可主動攻擊宿主細胞，輔助供者干細胞成功植入。供者來源的NK細胞（無論是原本存在于移植物中的還是由植入干細胞新分化發育的）都對促進植入有重要作用。當供受者KIR不相合引發供者NK細胞異源反應性時，供者NK 細胞通過識別殺傷受者殘留淋巴細胞和造血細胞而發揮強有力的促植入作用［9］。Peters等［10］的臨床研究發現，5例高危急性白血病患者經單倍相合異基因造血干細胞移植后，輸注純化的供者NK細胞可增加穩定嵌合體的形成，進一步證實了供者NK細胞可鞏固移植物植入。

NK細胞與GVHD

GVHD的發生主要由T細胞介導。這一過程始于供者T細胞伴隨造血干細胞進入受者體內與受者抗原相遇。啟動GVHD的關鍵的第一步是抗原呈遞細胞（APC）向供者CD8+T細胞呈遞主要和次要組織相容性抗原。NK細胞并不引發GVHD。研究發現，在鼠類供受者H-2相合但仍可發揮供者NK細胞異源反應性的干細胞移植實驗中，無GVHD出現，而且給受體鼠大劑量輸注不相合NK細胞克隆也不引發GVHD［11］。進一步在臨床移植觀察中，單倍相合的allo-HSCT后的供者NK細胞輸注是可耐受的，并不導致GVHD。然而，由于GVHD誘發的細胞表面分子上調并通過NKG2D配體激活NK細胞，使得NK細胞可能促進靶細胞的損傷。另一方面，在HLA不相合干細胞移植中，供者NK細胞可通過表達LFA-1（淋巴細胞功能相關抗原1，是一種黏附分子，介導NK細胞與靶細胞結合）的造血系統特異靶細胞減輕GVHD。供者異源反應性NK細胞可于輸注后數小時之內殺滅受者淋巴細胞、骨髓細胞及APC［11］。理論上APC為啟動GVHD所需，故輸注異源反應性NK細胞應可以減輕GVHD。臨床研究數據支持這一假說：在單倍相合和非親緣供者異基因造血干細胞移植中，存在NK細胞異源反應性的供-受者的GVHD發生率確實低于KIR相合者［12］。

轉貼于 　　NK細胞與GVL

在相同預處理條件下，allo-HSCT治療惡性血液病的復發率低于自體造血干細胞移植。目前認為，其主要原因是異源反應性NK細胞、T細胞所產生的GVL效應［13］。NK 細胞與T細胞的異體反應性的區別顯示，在HLA不相合移植中T細胞是GVHD的主要效應細胞，而NK細胞在移植物植入及GVL中起主要作用。前面已提到造血細胞對NK細胞的攻擊很敏感，根據“丟失自我”識別模式，當NK細胞遇到KIR不相容的白血病細胞（靶細胞）時，就會顯示出強大的細胞毒作用，而在KIR相合或自體造血干細胞移植中無此作用。將人類異源反應性NK細胞克隆輸注到已植入人AML細胞轉染性NOD/SCID小鼠D的實驗研究發現：未治療組及給予人無異源反應性NK細胞克隆組小鼠均于3周內死亡；而輸入人異源反應性NK細胞組（即使輸入的細胞數很少），這些異源反應性NK細胞即可清除白血病細胞并使小鼠存活120天。動物實驗及臨床移植均證實由KIR不相合產生的異源反應性NK細胞是allo-HSCT預后的有利因素。

NK細胞的“不利影響”

如前所述，異源反應性NK細胞在allo-HSCT中有許多有利作用，目前這方面的理論研究及臨床實踐很多。但近期一些臨床研究也得出一些KIR-配體不相合引起的異源反應性NK細胞對移植的不良影響。一方面，Ruggeri等［14］最近仍報道單倍相合造血干細胞移植后，異源反應活性NK細胞介導的供者抗受者異源性反應可減少AML患者復發危險，改善植入，減輕GVHD；并進一步提出臨床應用中可通過供者及受者高分辨HLA基因配型，積極鑒定供者KIR基因，甚至在一些病例中根據供者NK細胞克隆功能評價選擇單倍體供者，均可能有助于增強鞏固供者抗受者的NK細胞異源反應性。但另一方面，Nguyen等［15］在10例AML經單倍相合造血干細胞移植患者中研究移植后的NK細胞重建，發現盡管10例中8例KIR配體不相合，10例AML患者單倍相合造血干細胞移植后NK細胞恢復中未觀察到GVL效應。且干細胞移植后產生的NK細胞表現出不成熟的表型：細胞毒性CD3(-) CD56(dim)亞型很少，表達KIR、NKp30 減少，而表達CD94/NKG2A增加。這些結果揭示，單倍相合干細胞移植后產生的NK 細胞 被阻滯在一種具有特殊表型特點的非成熟階段，功能不全，對免疫應答及抑制恢復有潛在影響。不成熟的NK細胞，及NKG2A的抑制作用減輕了GVL效應。同時，Malmberg等［3］，Schaffer等［4］在190例非親緣供者造血干細胞移植中（KIR-配體不相合者167例，相合者23例）的最新研究發現，KIR-配體不相合引起的NK細胞異源反應性與TRM升高及總存活率下降有關。這主要由嚴重感染引起，考慮由KIR-配體不相合引起的同種異源反應性NK細胞的存在可能潛在地阻礙了機體對移植后早期感染的有效免疫。目前看來，allo-HSCT后的造血重建與免疫重建非常復雜，其中NK細胞作用有待進一步探討。伴隨供者干細胞進入受者體內的成熟NK細胞與由供者干細胞在受者體內逐漸發育分化而來的NK細胞對移植后免疫是否有不同的影響，仍需進一步研究；同時，KIR-配體不相合在移植中的意義有待進一步評價。

臨床展望

從臨床應用來說，雖然對于異源反應性NK細胞在allo-HSCT中的作用仍存在許多爭議，但根據其有利的作用，供者NK細胞輸注已從實驗動物研究開始逐漸用于臨床，目前報道未出現明顯不良反應［10］。對臨床治療思路有幾方面啟示： 首先，移植前進行供受者HLA配型并結合KIR基因鑒定，盡可能為選擇更合適的供者提供依據；其次，NK細胞可加速APC從受者骨髓、脾臟等部位的清除，減輕GVHD，因而可無需使用針對T細胞的免疫抑制處理方法，這為降低GVHD發生設計了另類策略［16，17］。再次，聯合供者異源反應性NK細胞輸注，有望降低異基因造血干細胞預處理強度，更進一步擴大適應癥范圍，使得高齡及臨床狀況差的患者也得到治療機會。

結語

隨著對移植免疫學及NK細胞生物學效應產生機制的深入研究，人們對NK細胞在allo-HSCT中的作用逐漸了解。NK細胞受體（NKR）中KIR與配體（MHC-Ⅰ類分子）的不相合是激活NK細胞殺傷作用、在異基因移植中產生異源反應性NK細胞的關鍵，因此這也成為目前研究的熱點。大部分研究結果顯示，異源反應性NK細胞有利于異基因造血干細胞植入，可減少GVHD，并發揮GVL作用。但對移植后免疫重建及患者總生存率的影響研究較少，臨床病例也缺乏長期觀察，故這些方面還有待進一步闡明。在臨床治療中，純化供者NK細胞的輸注已在干細胞移植及惡性實體瘤生物治療等方面取得了良好效果，并對干細胞移植治療策略產生了重大影響。如何更好的發揮NK細胞功能，將是allo-HSCT治療及腫瘤免疫治療的研究重點。

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nk細胞范文第2篇

題目：表觀遺傳學調控NK細胞分化及功能的研究進展

表觀遺傳學 (epigenetics) 是指在基因核苷酸序列不發生變化的情況下, 通過對轉錄表達的調控和轉錄后的調控使基因表達發生變化, 包括DNA甲基化、組蛋白共價修飾、染色質重塑、基因印記、及非編碼RNA、微小RNA (miRNA) 、反義RNA轉錄后調控等[1]。環境、年齡改變、壓力、疾病狀態等, 均可以引起免疫細胞表觀遺傳學改變, 造成免疫系統功能紊亂, 導致疾病的發生與進展。因此, 表觀遺傳學逐漸成為免疫學研究的熱點。

自然殺傷細胞 (natural killer cell, NK) 是天然免疫細胞, 主要來源于造血干細胞, 全身廣泛分布。NK細胞通過一系列細胞生物學過程獲得激活信號, 包括胞外鈣離子內流、細胞骨架重排以及與靶細胞接觸部位免疫突觸形成, 最終通過分泌細胞因子、趨化因子及釋放毒性顆粒執行清除病毒、腫瘤細胞以及發揮免疫調節功能。NK細胞功能異常導致多種疾病發生, 包括感染、腫瘤及自身免疫疾病[2,3]。近年來, 有很多學者先后報道了表觀遺傳學改變對NK細胞增殖、分化及功能的影響, 為NK細胞研究提供了新思路, 為新藥的臨床應用奠定了理論基礎。本文對NK細胞的表觀遺傳學研究進展作一綜述。

1 表觀遺傳學對NK細胞分化的影響

人類NK細胞表面特異性表達CD56或CD16分子, 根據其表達水平將NK細胞分為CD3-CD56bright CD16- (CD56bright) 、CD3-CD56dimCD16+ (CD56dim) 、CD3-CD56-CD16+3個亞群[4]。其中CD56bright亞群為調節性NK細胞, 可以參與適應性免疫調節, 通過分泌細胞因子和趨化因子 (IFN-、TNF-、IL-10、IL-13和GM-CSF) 對樹突狀細胞 (DCs) 、調節性T細胞 (Tregs) 、輔T細胞 (Ths) 及細胞毒性T細胞 (CTLs) 等進行免疫調控[5]。在類風濕關節炎中, NK細胞可以通過分泌IFN-誘導B細胞活化, 促進DC細胞成熟, 并可抑制T細胞向Th17細胞分化[6]。NK細胞分泌IFN-可以促進DC細胞分泌IL-27, 而IL-27可促進IFN-分泌, 這種正反饋參與抑制Th17介導的自身免疫疾病[7]。人和小鼠NK細胞均可通過分泌IFN-可以抑制CD4+T細胞向Tregs分化[8]。CD56dim為功能性NK細胞, 通過穿孔素/顆粒酶途徑、Fas/FasL途徑、TNF-а/TNFR-1途徑、以及抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用 (ADCC) 完成對靶細胞的直接殺傷。近期也有研究者發現, 功能性NK細胞參與適應性免疫的調節, 直接殺傷適應性免疫細胞, 如Th17及濾泡輔T細胞 (Tfh) [9]。而CD3-CD56-CD16+亞群目前研究較少, 目前認為主要發揮ADCC作用。

表觀遺傳學修飾在NK細胞的分化、成熟中發揮了重要作用。早期的研究顯示, IL-15受體信號通路對NK細胞的分化成熟至關重要, E4BP4 (NFIL3) 在其中發揮調節作用, 促進了造血干細胞 (HSC) 向NK細胞分化。動物實驗顯示, E4BP4基因缺陷小鼠NK細胞減少、功能下降, 而過表達E4BP4可增加Id2和Gata3的轉錄, 從而促進HSC向NK細胞分化增加[10]。在NK細胞發育中, 組蛋白甲基化也具有重要調控作用。Yin等[11]研究了zeste基因增強子同源物2 (EZH2) 對早期NK細胞分化的影響。EZH2作為重要的表觀遺傳修飾酶, 是PcG (polycomb group) 蛋白家族的重要成員, 在調控基因表達的過程中起關鍵作用[12]。EZH2主要對組蛋白H3K27進行甲基化, 從而沉默下游基因, 在細胞增殖、分化及腫瘤形成方面都有重要作用[13]。研究者[11]發現, 在小鼠及人中, 選擇性失活EZH2或用小分子抑制其活性后, 可以增加IL-15受體 (CD122+) 陽性的NK祖細胞數量, 并促進成熟NK細胞增殖。NK細胞的擴增及殺傷作用還與CD122及NKG2D有關, NKG2D缺失可降低EZH2抑制劑對促進NK細胞增殖及分化的作用。另外, Tsuyama等[14]研究報道, NKT細胞淋巴瘤患者存在組蛋白去甲基化酶KDM6A基因突變, 此基因與血液腫瘤關系密切, 可能影響NK細胞的增殖。

FcRIIIA (CD16a) 由FCGR3A編碼, 為NK細胞在成熟過程中獲得。研究發現, 在CD16a+細胞中, FCGR3A啟動子中轉錄起始位點的甲基化水平較CD16a-細胞和中性粒細胞明顯降低。此外, 研究者還發現miR-218是NK細胞CD16a轉錄后的負調控因子。在NK細胞中過度表達miR-218可降低CD16a的mRNA和蛋白表達水平, miR-218在CD16a-細胞中水平明顯高于CD16a+細胞。因此, 研究者推斷, FCGR3A的轉錄起始位點甲基化及轉錄后miR-218的調控作用可以通過改變CD16a的表達來調節NK細胞的分化成熟[15]。

記憶性NK細胞的概念由Sun等[16]最早提出。這類NK細胞可以長期存活, 具有免疫記憶功能, 當再次接觸到記憶抗原時被激活。多種病毒可以誘導記憶性NK細胞產生, 目前報道的有巨細胞病毒, 單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒等[17,18]。記憶性NK細胞表達CD57和NKG2C, 不表達FcR、SYK、DAB2、ETA-2、PLZF和ILZF2。FcR、ETA-2、SYK的缺乏均有表觀遺傳學機制的參與[19,20]。IL-12信號通路通過其下游轉錄因子信號和轉錄因子4 (STAT4) 的激活影響記憶性NK細胞的擴增。Rapp等[21]發現Runx1和Runx3的啟動子區域是STAT4的結合位點, 在NK細胞活化過程中, STAT4的結合會誘導RUNX基因位點的表觀遺傳學修飾, 從而導致表達增加。在病毒感染中, Runx1和Runx3或它們的伴侶分子表達減低是影響NK細胞擴增及記憶NK細胞形成障礙的原因。該研究證明, STAT4介導的Runx轉錄因子表觀遺傳學修飾可以調節NK細胞對病毒的適應行為。

2 表觀遺傳學對NK細胞功能的影響

NK細胞的功能主要包括殺傷及免疫調節作用。有研究顯示, 在NK細胞活化過程中, 81%的主要位點出現CpG去甲基化, 生物學分析顯示差異甲基化位點主要集中在免疫調節功能中 (如TNFA、LTA、IL-13、CSF2等) [22], 這提示表觀遺傳學修飾參與了NK細胞的活化, 并與NK細胞功能關系密切。

2.1 表觀遺傳學修飾對NK細胞表面受體的調節作用

NK細胞表面激活性受體與抑制性受體的相互平衡, 在NK細胞功能中發揮了重要調節作用。如激活性受體表達占優, 則NK細胞活化, 反之, NK細胞處于靜止狀態。

有學者[23,24,25]檢測了NK細胞免疫球蛋白樣受體 (KIR) 啟動子的甲基化水平, 結果發現, 處于靜息狀態的人NK細胞92細胞系中KIR2DL1、KIR2DL2/L3高甲基化, 同時, 細胞表面的KIR表達降低。當應用5-氮雜胞苷進行去甲基化處理后, KIR啟動子去甲基化, NK細胞表面KIR表達明顯增加。另外, KIR的表達受miRNA調節。PIWI樣RNA可以誘導KIR雙向啟動子KIR3DL1產生KIR反義轉錄本, 影響雙鏈DNA的合成, 可減少90%的KIR表達[25]。

NKG2D是NK細胞激活性受體, 其表達增加可增強NK細胞功能。NKG2D通過識別不同的配體家族 (MICA、MICB、ULBPs 1-6等) 參與激活效應細胞、溶解靶細胞。NKG2D基因在NKG2D+NK細胞中去甲基化, 并與組蛋白H3賴氨酸9乙酰化 (H3K9Ac) 相關。用組蛋白乙酰轉移酶 (HAT) 抑制劑 (姜黃素) 可以明顯下調NKG2D基因H3K9乙酰化水平, 進而下調NKG2D的轉錄, 導致NKG2D表達減低, NK細胞殺傷功能下降。此研究提示NKG2D在NK細胞表面表達差異是由表觀遺傳學機制調節的, 并可以通過表觀遺傳治療改善[26]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑丙戊酸 (VPA) 通過激活基因啟動子中組蛋白K9的高甲基化和DNA甲基化, 從而下調NKG2D的表達[27]。同樣, miRNA也可發揮對NKG2D的調節作用。在HCV感染患者的NK細胞中, miR-182與對照組相比過表達, miR-182表達升高可降低NKG2D的mRNA水平, 而miR-182抑制劑能降低抑制性受體NKG2A的mRNA水平[28]。

2.2 表觀遺傳學修飾對NK細胞細胞因子分泌水平的調節作用

NK細胞分泌細胞因子同樣受到表觀遺傳學修飾的調節。Luetke-Eversloh等[29]報道, NK細胞受到刺激后, IFN-及T-bet位點轉錄增加, 并發生去甲基化, 從而增加IFN-的分泌。Li等[30]發現, 在NK細胞激活過程中, 組蛋白去甲基化酶及甲基轉移酶發生明顯變化。在NK92細胞系中, 與NK細胞激活密切相關的PI3KCA, 、NFATC1及TNFSF9等基因, 經PMA和依諾霉素刺激可出現H3K4me3和H3K27甲基化修飾, 從而調控上述基因表達。采用H3K4和H3K37的特異性抑制劑可以增加NK細胞脫顆粒及IFN-、TNF-的分泌[22,30]。Cribbs等[31]用染色質甲基化及乙酰化的小分子抑制劑進行篩選, 并通過基因敲除方法確定了Jumonli型組蛋白H3K27脫甲基酶是NK細胞分泌細胞因子的關鍵調節因子。JMJD3/UTX (含有Jumonji結構域的蛋白3) H3K27去甲基化酶抑制劑GSK-J4可引發細胞因子轉錄起始位點H3K27甲基化, 并造成NK細胞IFN-、TNF-、GM-CSF、IL-10分泌下降。GSK-J4可以明顯抑制類風濕性關節炎患者外周血或組織中分離出的NK細胞的細胞因子分泌, 抑制破骨細胞形成及骨破壞。除甲基化外, 組蛋白乙酰化修飾也對NK細胞細胞因子分泌起調節作用。VPA可抑制NK細胞對白血病細胞的溶解, 并且有劑量依賴性。VPA預處理可降低NK細胞IFN-分泌, 破壞CD107A脫顆粒, 并通過激活PD-1/PD-L1途徑誘導細胞凋亡[27]。

H3K4me3脫甲基酶KDM5A調節基因轉錄并參與腫瘤的發生。Zhao等[32]研究證明KDM5A缺陷使IFN-產生減少, 并損害NK細胞的活化。KDM5A (-/-) 小鼠對單核細胞增生李斯特氏菌 (LM) 感染高度敏感。在NK細胞活化過程中, KDM5A的缺失影響STAT4磷酸化和核定位, 并增加了細胞因子信號轉導抑制因子1 (SOCS1) 的表達。進一步研究揭示其機制為KDM5A與P50結合, 并與靜止NK細胞中的SOCS1啟動子區結合, 抑制染色質重塑, 導致在SOCS1啟動子中H3K4me3修飾顯著減少。

另外, Lee等[19]在研究記憶性NK細胞時發現, 人巨細胞病毒感染后, NK細胞Syk轉錄起始位點甲基化, Syk基因沉默, 可引起表達IFN-水平升高。BHLHE40為轉錄調節因子, 在活化的NK細胞中去甲基化, 誘導細胞因子分泌 (如IL-2、IL-12、IL-15、IFN、TNFA等) , 增強NK細胞功能。NFAT轉錄因子家族通過與啟動子及增強子區域結合來增加NK細胞因子的表達。在活化的NK細胞中, NFATC1內含子9明顯去甲基化, 可調節NK細胞分泌細胞因子[22]。

3 引起NK細胞表觀遺傳學變化的因素

多種疾病狀態下, NK細胞的表觀遺傳學修飾會發生變化, 如巨細胞病毒感染會激活NK細胞, 引起81%的位點發生DNA去甲基化[22]。在兒童哮喘患者中, NK細胞DNA去甲基化, 引起NK細胞活性升高[33]。在類風濕關節炎及強制性脊柱炎中, NK細胞均存在表觀遺傳學改變[31,32,33,34]。

一些藥物可以引起NK細胞的表觀遺傳修飾變化。Misale等[35]報道, 糖皮質激素可以通過影響H3K27me3來降低IFN-的表達, 從而抑制NK細胞的免疫功能。5-氮雜胞苷可引起NK細胞DNA去甲基化, 誘導相關基因激活, 促進NK細胞活化[36]。

運動也可以引起NK細胞表觀遺傳學修飾發生改變。Zimmer等[37]選取30例非霍奇金淋巴瘤患者及10名健康人, 干預組每人每天騎車運動30min。運動組的患者血清巨噬細胞游走抑制因子 (MIF) 及IL-6水平升高, NK細胞組蛋白H3、H4乙酰化水平降低。近期, 研究者再次證明運動可以通過升高組蛋白乙酰化水平及NKG2D的表達, 改善正常人NK細胞活化狀態[38]。

壓力及年齡的增長對NK細胞的表觀遺傳學也有明顯影響。創傷后應激綜合征可以加速NK細胞由年齡造成的甲基化水平升高, 從而影響機體免疫狀態[39]。

綜上所述, 表觀遺傳學修飾影響著NK細胞的增殖、分化、殺傷、免疫調節等, 在NK細胞調控中, 扮演重要角色。但目前, NK細胞表觀遺傳學研究多集中在基礎實驗階段, 在臨床疾病中的應用很少。NK細胞參與腫瘤、自身免疫疾病及感染的發病, 其異常是否與表觀遺傳學修飾有關?進一步研究NK細胞表觀遺傳學異常在疾病發生中的作用, 將基礎研究向臨床應用轉化, 開拓疾病中NK細胞功能異常的新思路, 并為新型藥物在臨床中的應用提供研究基礎, 將是本課題組今后努力的方向。

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nk細胞范文第3篇

【關鍵詞】NK細胞：CIK細胞；γδT細胞：化療：小細胞肺癌

【中圖分類號】R59

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-0742（ 2015） 06（b）-0059-02

肺癌是臨床最常見的惡性腫瘤之一，致死率及發病率在惡性腫瘤中居高不下，成為當前威脅人類生命健康安全的頭號殺手。據不完全數據分析，小細胞肺癌（SCLC）發病率占肺癌發病率的15%～20%，多發于中老年男性，與吸煙關系密切，約90%以上的患者存在吸煙史。該疾病早期癥狀具有一定隱匿性，多數患者以咳嗽、氣促、疼痛、咯血、乏力等表現為主，部分因未出現上述癥狀而延遲病情診斷，錯過最佳時間。當前越來越多研究報道顯示，SCLC患者存在多種免疫細胞功能缺陷，故研究者將探討方向轉移至改善患者免疫狀態上，希望以此開辟新途徑，提高SCLC患者治療效果，延長其生存時間。該研究整群選取2009年8月一2014年12月間該院收治的94例小細胞肺癌患者為研究對象，以此為方向展開討論，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

整群選取該院于2009年8月-2014年12月收治的94例小細胞肺癌患者為研究對象，均通過病理檢杏及細胞診斷，符合《NCCN臨床腫瘤治療指南（2010年第1版）》中小細胞肺癌相關診斷及分期標準。根據患者人院順序分成聯合組（A組，n=47）和對照組（B組，n=47）兩組，A組中男25例，女22例；年齡19～62歲，平均（48.3±4.4）歲；Karnofsky功能狀態（KPS）評分（80.1±3.8）分；體力狀況ECOC評分（1.1±0.5）分；病情發展：局限期29例，廣泛期18例。B組中男24例，女23例；年齡20～63歲，平均（48.6±4.5）歲；KPS評分（80.3±3.9）分；ECOC評分（1.3±0.6）分；病情發展：局限期28例，廣泛期19例。兩組患者在一般資料對比上差異無統計學意義（P>0.05），具有可比降。

1.2 納入標準

①符合小細胞肺癌相關診斷標準者；②符合《NCCN臨床腫瘤治療指南（2010年第1版）》中相關化療指證（KPS≥70分且Ps≤2分）者；③臨床資料完整者；④預計存活期超過3個月者；⑤自愿簽署的知情同意書者。

1.3 排除標準

①合并其他嚴重疾病、功能障礙或惡性腫瘤者；②相關治療禁忌癥者；③精神障礙、意識障礙或語言障礙者；④中途退出治療或隨訪期失聯者；⑤未成年患者或年齡超過65歲者。

1.4 治療方法

1.4.1 B組予以單純化療方案①依托泊苷注射液（規格：5mLO.Ig，批準文號：國藥準字05253H823），100m/m?，生理鹽水稀釋后靜脈滴注，濃度30min，dl-3；②注射用順鉑（規格：1Omg，批準文號：國藥準字H20073652），75mg/m?，與5%葡萄糖注射液稀釋后靜脈滴注，滴注時間>30min，dl；局限期患者治療4周，廣泛期患者治療6周后觀察效果。

1.4.2 A組采用細胞免疫聯合化療方案①化療方案同B組一致；②過繼性細胞免疫治療：治療第1天采集患者白體外周血單個核細胞，體外培養擴增后于2周后回輸NK細胞、CIK細胞及γδT細胞，持續6d，維持治療至疾病進展。

1.5 評估標準

1.5.1 療效評估標準參考《實體瘤新的療效評價標準（解讀1.1版RECIST標準）中相關標準。以患者無進展生存期（PFS）及總生存期（os）長短評估療效。

1.5.2 觀察指標行為期2～5年隨訪，比對兩組患者總生存期及無進展生存期差異，記錄其相關不良反應發生情況。

1.6 統計方法

應用統計學軟件SPSS14.0分析數據，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，計數資料以百分率表示，采用X2檢驗，P

2 結果

2.1 生存率及生存期對比情況分析

A.B兩組的局限期患者在PFS及1年生存率對比上差異無統計學意義（P>0.05）；A組局限期患者Os及2年生存率優于B組，差異有統計學意義（P

2.2 不良反應發生情況對比分析

兩組患者不良反應發生率對比差異無統計學意義（P>0.05）；詳細見表3。

3 討論

nk細胞范文第4篇

目的: 探討nkg2d配體在不同發育階段樹突狀細胞（dc）表面的表達及其對自然殺傷（nk）細胞殺傷活性的影響。方法: 用細胞因子（rh il-4、 rhgm-csf、 tnf-α）體外誘導培養單核細胞來源的未成熟樹突狀細胞（idc）和成熟樹突狀細胞（mdc）并鑒定形態和表型, 免疫磁珠法分離純化nk細胞。流式細胞術（fcm）檢測idc和mdc表面nkg2d配體mica/b、 ulbp1-3的表達。用ldh釋放法檢測nk細胞對idc和mdc的殺傷活性以及抗nkg2d單克隆抗體(mab)阻斷nk細胞后的殺傷活性。結果: 培養的idc和mdc具有典型的細胞形態和免疫表型特征。idc表面表達mica、 micb、 ulbp1、 ulbp3, 表達率分別為(32.39±8.30）%、 (17.75±3.40)%、 (26.71±6.48)%、 (38.37±6.89)%; mdc表面表達mica 、 ulbp3, 表達率分別為(7.82±2.67)%、 (8.36±2.42)%, 比idc表面相應配體表達率低（p<0.01）。各效靶比nk細胞對idc的殺傷活性均比對mdc的殺傷活性高, 差異有統計學意義(p<0.01)。抗nkg2d mab阻斷nk細胞后對idc殺傷活性比阻斷前減弱(p<0.05); 對mdc的殺傷活性與阻斷前相比無統計學意義(p>0.05)。結論: nkg2d配體在idc表面表達高, 介導了nk細胞對idc的殺傷, 而對mdc的殺傷無影響, 是nk細胞對idc選擇性高殺傷的分子機制之一。wWw.133229.cOm

【關鍵詞】 nkg2d配體 自然殺傷細胞 樹突狀細胞

expression of nkg2d ligands on dendritic cells at different development stages and its effect on cytotoxicity of nk cells

tu san-fang, guo kun-yuan*, hu liang-shan, mei jia-zhuan, zhou jian, sun ming

department of hematology, zhujiang hospital, southern medical university, guangzhou 510282, china

［abstract］ aim: to investigate the expression of nkg2d ligands on dendritic cells（dc） at different development stages and its effect on cytotoxicity of natural killer（nk） cells. methods: the monocytes were cultured into immature dendritic cells（idc） and mature dendritic cells（mdc） with cytokines. nk cells were obtained from normal peripheral blood by cd56 antibody magnetic isolation.the expression of nkg2d ligands (mica/b, ulbp1-3) was detected by flow cytometry. cytotoxicity of nk cells and the nk cells blocked with anti-nkg2d mabs against idc and mdc was tested using ldh-releasing method. results: idc and mdc were of typical morphology and phenotypes. mica, micb, ulbp1, and ulbp3 were expressed on idc and their expression rate was (32.39±8.30)%, (17.75±3.40)%, (26.71±6.48)%, (38.37±6.89)%, respectively. mica and ulbp3 were expressed on mdc and their expression rate was (7.81±3.33)% and (8.36±2.42)%, respectively, which was lower than that on mdc (p<0.01). at the each e∶t ratio cytotoxicity of nk cells against idc was stronger than that against mdc (p<0.01). cytotoxicity of nk cells blocked with anti-nkg2d mab against idc was decreased compared with that of nk cells unblocked (p<0.05) while cytotoxicity of nk cells blocked with anti-nkg2d mab against mdc showed no decrease compared with that of nk cells unblocked (p>0.05). conclusion: the expression of nkg2d ligands on idc is higher than that on mdc, which plays an important role in the cytotoxic effect of nk cells against idc, but has no effect on that aginst mdc. nkg2d-nkg2d ligands shows one of the moleculer mechanisms that nk cells kill idc selectivly.

［keywords］nkg2d ligand; natural killer cell; dendritic cell

樹突狀細胞（dc）和自然殺傷（nk）細胞是機體免疫系統最重要的組成部分, 二者之間存在相互作用［1］。ruggeri等［2, 3］研究發現在異基因造血干細胞移植中供者nk細胞可以通過殺傷宿主dc來降低移植物抗宿主病（gvhd）的發生。但nk細胞殺傷dc的作用機制仍未完全明確。nk細胞主要通過表面受配體結合起殺傷作用, 本研究旨在通過檢測nkg2d配體在不同發育階段dc表面的表達水平來探索nkg2d受配體識別途徑是否參與介導了nk細胞對不同發育階段dc的殺傷, 為臨床運用nk細胞降低gvhd的發生提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料 rpmi1640培養基和胎牛血清購自gibco公司。重組人白細胞介素-4 ( rh il-4)、 重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子( rhgm-csf)和腫瘤壞死因子（tnf-α）均為pep rotech公司產品。抗cd56免疫磁珠抗體、 macs磁柱和macs細胞分選儀均為miltenyi公司產品。殺傷活性檢測試劑盒（cytotox96 non-radioactive cytotoxocity assay）為promega公司產品。cd3fitc、 cd16pecd56pe mab為bd公司產品。fitc或pe標記的鼠抗人cd80、 cd86、 hla2dr、 cd83、 cd1a單克隆抗體(mab)及其同型對照均為ebiosience公司產品。鼠抗人nkg2d、 mica、 micb、 ulbp1、 ulbp2、 ulbp3 mab和fitc標記的兔抗鼠igg1購自rnd公司。facscabilur型流式細胞儀為beckman-coulter公司產品。

1.2 方法

1.2.1 人外周血單核細胞來源的idc與mdc體外誘導培養與鑒定 常規分離健康志愿者外周血單個核細胞, 以4×109/l細胞密度接種在6孔板中, 置于37℃、 50 ml/l co2培養箱中貼壁培養4 h后, 去除非貼壁細胞, 加入含20 μg/l rhil-4、 50 μg /l rhgm-csf、 100 ml/l胎牛血清的rpmi1640培養液, 置于培養箱培養, 隔天半量換液, 補充等量細胞因子。第6天補加80 μg /l的tnf-α, 共培養9 d。每天倒置顯微鏡下觀察細胞形態。收集第6天和第9天細胞用25 ml/l戊二醛固定, 漂洗, 脫水, 乙酸異物脂置換, 干燥, 噴金后上機用掃描電子顯微鏡觀察鑒定其形態。同樣收集第6天和第9天細胞計數后分管, 分別加cd80pe、 cd86 pe-cy5、 hla-drpe、 cd1afe、 cd83fitc mab 4度標記, 對照管加同型對照igg1, 用流式細胞術（fcm）檢測各分子的表達, 不同時間點重復3次。

1.2.2 人外周血來源的nk細胞分離 分離另外3位健康志愿者外周血單個核細胞, 每107個細胞加入80 μl pbs和20 μl抗cd56免疫磁珠抗體, 4℃標記15 min后洗滌, 用500 μl的pbs充分混勻后加入到磁柱中, 在macs細胞分選儀中分離, 推注器將分選的陽性細胞推入無菌試管, 為nk細胞。cd3fitc、 cd16pecd56pe mab標記nk細胞檢測nk細胞的純度。

1.2.3 idc、 mdc表面nkg2d配體的fcm檢測 分別收集鑒定后的idc與mdc洗滌計數, 分6管, 每管109/100 ml細胞懸液, 按1 μg/106個細胞密度分別加入mica、 micb、 ulbp1、 ulbp2、 ulbp3 mab, 4度標記30 min后洗滌, 加入fitc標記的山羊抗鼠igg1二抗4度標記30 min, 第6管加等量同型igg1作為陰性對照, 洗滌后以fcm檢測mica、 micb、 ulbp1、 ulbp2、 ulbp3的表達量。為避免實驗誤差, 不同時間點重復3次。

1.2.4 nk細胞對idc與mdc殺傷活性的檢測 采用ldh釋放法［4］, 收集idc, mdc作為靶細胞, nk細胞為效應細胞, 按照cytotox96 non-radioactive cytotoxocity assay殺傷試劑盒說明書操作, 倍比稀釋法按效靶比20∶1、 10∶1、 5∶1鋪板, 阻斷組先加抗nkg2d mab 10 μg/100 μl常溫下孵育15 min, 封閉nk細胞表面nkg2d受體, 再加靶細胞。顯色后elx-800酶標儀上測a值。nk細胞殺傷率=(實驗孔a值－靶細胞自發釋放孔a值－效應細胞自發釋放孔a值)/(靶細胞最大釋放孔a值－靶細胞自發釋放孔a值)×100%

1.2.5 統計學處理 應用spss13.0統計軟件進行數據處理, 數據以x±s表示, 采用獨立樣本t檢驗, p<0.05者表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 idc和mdc的形態和表型 倒置顯微鏡下觀察第6天細胞大部分半懸浮聚集成簇生長, 胞體增大, 表面可見短小毛刺狀突起。第9天細胞大部分懸浮生長, 表面樹突結構明顯。掃面電鏡下觀察第6天細胞大小10 μm左右, 表面突起短小, 多見薄沙或云霧狀皺褶, 符合idc的形態特征（圖1a）; 第9天細胞表面突起更多更長, 呈典型樹突狀結構, 云霧狀皺褶稀疏, 符合mdc的形態特征（圖1b）。fcm結果顯示第6天dc表面共刺激分子cd80和cd86分別為（40.8±7.9）%和（45.1±3.7）%, hla-dr表達為（59.9±5.2）%, 特異性分子標志物cd1a高表達為（71.9±5.2）%, 成熟分子標志物cd83低表達為（14.9±1.9）%, 為不成熟階段表型。第9天測得cd80、 cd86和hla-dr表達升高為（71.5±7.3）%、 （79.9±6.7）%和（88.6±6.6）%, cd1a仍高表達, cd83表達升高為(65.5±3.8)%, 為成熟階段表型。

圖1 掃描電鏡下觀察dc形態（略）

fig 1 the morphologies of dc observed by scanning electron microscope

a: day 6; b: day 9.

2.2 nk細胞的純度 fcm結果顯示外周血單個核細胞經免疫磁珠分選后nk細胞（cd3-cd16+cd56+）的純度為（91.66±4.04）%, 能滿足實驗要求（圖2）。

圖2 免疫磁珠法分選后nk細胞的純度（略）

fig 2 purification of nk cells after immunomagnetic isolation

2.3 idc和mdc表面nkg2d配體的表達 idc表面表達mica、 micb、 ulbp1和ulbp34個配體; mdc表面只表達mica、 ulbp22個配體, 且比idc表面相應配體表達率低, 差異均有統計學意義（p<0.01）。其他配體表達率均低于5%, 視為陰性結果(表1, 圖3)。

表1 nkg2d配體在idc和mdc表面的表達率（略）

tab 1 expression of nkg2d ligands on the surface of idc and mdc

bp<0.01 vs idc.

圖3 idc和mdc膜表面nkg2d配體的表達（略）

fig 3 expression of nkg2d ligands on the surface of idc and mdc

2.3 nk細胞對idc與mdc的殺傷活性 各效靶比nk細胞對idc的殺傷活性分別高于對mdc的殺傷活性, 差異均有統計學意義（p<0.01）。nkg2d mab阻斷nk細胞后, 各效靶比nk細胞對idc的殺傷活性降低（p<0.05）; 對mdc的殺傷活性與阻斷前相比均無統計學意義（p>0.05）; 阻斷后的nk細胞對idc的殺傷活性比阻斷前nk細胞對mdc的殺傷活性高, 差異有統計學意義（p<0.05, 圖4）。

圖4抗nkg2d mab阻斷前后nk細胞對idc和mdc的殺傷活性（略）

fig 4 cytotoxicity of nk cells and the nk cells blocked with anti-nkg2d mab against idc and mdc

3 討論

nk細胞和dc是機體天然免疫和獲得性免疫系統中重要的組成部分, 近年來研究［1, 5］表明二者在天然免疫早期階段存在相互作用, dc能增強nk細胞的殺傷活性, 同時nk細胞能選擇性殺傷idc, 到目前為止其殺傷機制仍在探索中。dc根據發育階段的不同可分為idc和mdc, 其在形態, 表型和功能上有所不同［6］。nk細胞的殺傷活性同時受活化性和抑制性受配體結合產生的信號平衡調節起作用［7］, 其活化性受體主要包括ii型跨膜蛋白受體nkg2d和nk細胞自然細胞毒受體ncr, 與配體結合向nk細胞傳遞活化性信號。nkg2d配體［8］主要包括多態性的mhc-i類鏈相關的肽a、 b（mica/b）和人巨細胞病毒ul16結合蛋白(ulbps), 它們在不同發育階段dc的表達情況尚未見研究報道。我們通過fcm分別檢測idc和mdc表面nkg2d配體的表達, 結果顯示idc表面表達mica、 micb、 ulbp1和ulbp3, 而mdc表面只表達mica和ulbp3, 且表達率很低。因此idc可以通過表面nkg2d配體與nkg2d結合激活nk細胞的殺傷活性, mdc通過nkg2d配體很難激活nk細胞。本研究殺傷試驗顯示nk細胞對idc的殺傷活性比對mdc的殺傷活性高很多, 與其他研究結果一致［9］。nkg2d mab阻斷nk細胞后降低了nk細胞對idc的殺傷活性, 但對mdc的殺傷沒有影響。因此可認為nkg2d受配體識別信號途徑介導了nk細胞對idc的殺傷, 沒有介導對mdc的殺傷, 是nk細胞選擇性高殺傷idc的機制之一。

nk細胞的殺傷作用除了受活化性信號作用之外, 同時受抑制性信號的共同調節作用。nk細胞抑制性信號受體主要包括殺傷細胞免疫球蛋白樣受體kir和cd94/nkg2a等, 分別與靶細胞表面的hla-ⅰ類分子和不典型的i類分子結合, 向nk細胞傳遞抑制性信號［10］。本研究結果顯示抗nkg2d mab阻斷后對idc的殺傷活性仍比未阻斷前nk對mdc的殺傷活性高, 說明抗nkg2d mab不能完全阻斷nk細胞對idc的殺傷, 同時其他受配體識別途徑介導。除了其他活化性信號途徑外, 更主要的就是抑制性信號在二者強弱不等。ferlazzo等［11］發現mdc高表達抑制性配體mhc-i類分子, 而idc低表達, 這可能也是idc被nk細胞選擇性殺傷的原因之一。

在異基因造血干細胞移植中利用nk細胞對idc 的殺傷清除能力, 輸入kir/hla錯配的nk細胞可能做為一種安全有效的過繼細胞免疫治療方法用于白血病的治療, 降低gvhd的發生。本研究發現nkg2d配體在idc表面表達, 并首次證實它直接影響nk細胞對idc的選擇性殺傷, 為臨床造血干細胞移植合理選擇供者提供了一定的理論依據。

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nk細胞范文第5篇

    神經膠質瘤是中樞神經系統最常見的原發性惡性腫瘤，其發病率占全部腦部腫瘤的50%以上。因其生長活躍，沿神經纖維呈浸潤性生長，與腦組織無明顯的界限，外科手術難以完全切除。加上腦組織對射線的耐受性差及血－腦脊液屏障對藥物滲透的限制作用，惡性神經膠質瘤對化療和放療僅為中度敏感，大部分腫瘤會在原腫瘤周邊0.5～3.0cm范圍內復發[1]。所以需要其他輔助治療方法來控制腫瘤的復發，以延長生存期，改善遠期療效。nk細胞是腫瘤免疫治療的新的研究熱點。隨著臨床和基礎研究進展，人們發現部分神經膠質瘤細胞有逃避nk細胞免疫殺傷的生物學行為[2]。本研究以k562細胞為對照，探討人神經膠質瘤細胞u251逃逸nk細胞殺傷的機制，為提高nk細胞免疫治療效果，尋找新的免疫治療方案提供新的思路。

    1  材料和方法

    1.1  主要試劑和細胞株  nk細胞分離緩沖液和抗cd56免疫磁珠(miltenyi biotec公司)，amo1(antimica, igg1)、bmo1 (antimicb, igg1)、m295(antiulbp1, igg1)、m310(antiulbp2, igg1)、m551(antiulbp3, igg1)(德國alexander. steinle教授惠贈)，fitc標記的鼠抗人hlaⅰ類分子單抗（w6/32, igg2a）和山羊抗小鼠igg (ebioscience公司)，rpmi1640(gibco公司)，ldh殺傷活性檢測試劑盒(promega公司)，trizol (invitrogen公司)，takara rna kit(amv)ver.3.0（takara公司），胎牛血清(杭州四季青公司)。人神經膠質瘤細胞株u251由中南大學湘雅醫學院遺傳研究所惠贈，人紅白血病細胞株k562由本室凍存。用含10%胎牛血清的rpmi1640培養基，在37℃、5%co2、充分濕度的孵箱中培養，實驗用細胞均處于對數生長期。

    1.2  nk細胞的分離純化  用梯度密度沉淀法常規分離5例健康個體外周血單個核細胞，pbs洗滌2次，計數細胞，按每107細胞加入80μl nk細胞分離緩沖液和20μl抗cd56免疫磁珠，4℃孵育15min，加入1ml的緩沖液，離心，棄上清。然后按108細胞/500μl緩沖液懸浮細胞，加入minimacs磁場中的分選柱，進行分離。用500μl緩沖液沖洗分選的陽性細胞，共3次。取下分選柱，置于無菌試管上，加入rpmi1640培養基1ml，用推注器推出分選的陽性細胞，獲得cd3-cd56+細胞即為nk細胞。

    1.3  nk細胞的細胞毒實驗  用5%胎牛血清rpmi1640懸浮u251和k562細胞，作為靶細胞，加于96孔板中，每孔1×104細胞/50μl。以nk細胞為效應細胞，按不同效靶比(5∶1、10∶1、20∶1、40∶1)分別加入相應數量的效應細胞50μl。另設培養基對照孔，效、靶細胞自然釋放孔，靶細胞最大釋放孔，各組均設3個復孔。于孵箱中培養4h，靶細胞最大釋放孔提前45min加10μl裂解液，離心，每孔吸取上清50μl轉入另一96孔板中，加入50μl ldh底物反應液，室溫避光放置30min，每孔加50μl反應終止液，酶標儀490nm處測od值。抗體封閉試驗以效靶比20∶1時，amo1、bmo1、m295、m310和m551分別與k562和u251細胞室溫孵育15min，再加入nk細胞檢測殺傷率。nk細胞殺傷率(%)=(實驗組od平均值-靶細胞自然釋放組od平均值-效應細胞自然釋放組od平均值)/(靶細胞最大釋放組od平均值-靶細胞自然釋放組od平均值)×100%。

    1.4  mhcⅰ類鏈相關分子a和b(mica/b)和人巨細胞病毒糖蛋白ul16結合蛋白(ulbp1～3) mrna的檢測  引物參考文獻[3]設計，由上海生工公司合成。收集k562和u251細胞，用trizol一步法直接提取總rna，紫外分光光度計測rna含量。取2μg總rna，加入20μl逆轉錄體系(25mm mgcl2 2μl、10mm dntp mixture 2μl、10×rt buffer 1μl、20μmol/l特異性下游引物0.5μl、rnase free ddh2o 3.75μl、rnase inhibitor 10u、amv reverse transcriptase 2.5u)混勻，50℃ 20min，99℃ 5min，5℃ 5min終止反應。直接在逆轉錄反應產物中加入40μl pcr反應體系(5×pcr buffer 10μl、takara ex taq 1.25u、20μmol/l上游特異性引物0.5μl、ddh2o 29.75μl)混勻。95℃預變性5min，95℃ 1min，65℃ 1min，72℃ 1min，35個循環，72℃ 10min終止反應。擴增產物經1.5％瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析儀觀察結果。

    1.5  mica/b和ulbp1～3和hlaⅰ分子測定  收集腫瘤細胞，pbs洗滌2次，計數細胞，分管，用直接標記法檢測hlaⅰ類分子，按1μg/106細胞濃度加入w6/32，4℃孵育30min，pbs洗滌3次。用間接標記法檢測mica/b和ulbp1～3分子的表達，加入amo1、bmo1、m295、m310和m551一抗，4℃作用30min，pbs洗滌后再加fitc標記的山羊抗鼠igg1二抗，4℃孵育30min，pbs洗滌后上機，以同型igg1抗體( pharmingen公司)為陰性對照。用流式細胞儀分析1×104細胞中陽性細胞數，計算百分率。為減少誤差，重復實驗3次。

    1.6  統計學方法  所有實驗數據以均數±標準差(±s)表示， 應用spss13.0軟件處理數據，采用獨立樣本t檢驗以及單向方差分析。

    2  結果

    2.1  nk細胞的純度  流式細胞儀檢測nk細胞(cd3-cd16+cd56+)的純度為（89.4±3.26）%。

    2.2  nk細胞殺傷活性

    2.2.1  不同效靶比時nk細胞殺傷k562和u251細胞的活性見表1。同一效靶比時nk細胞對兩種細胞的殺傷率之間的差異有統計學意義(p＜0.05)。不同效靶比之間nk細胞對k562細胞殺傷率的差異有統計學意義(p＜0.05)，對u251細胞殺傷率的差異無統計學意義(p＞0.05)。表1  不同效靶比時nk細胞殺傷k562

    和u251細胞的情況（％，±s）

    5∶110∶120∶140∶1k562細胞29.32±1.1745.33±1.7858.37±2.3572.37±3.06  u251細胞4.69±0.323.47±0.845.36±1.135.81±0.82

    2.2.2  效靶比20∶1時用抗體分別封閉靶細胞表面相應分子后nk細胞的殺傷情況見表2。阻斷靶細胞nkg2d的各配體，nk細胞對k562細胞殺傷率有明顯下降，對u251細胞的殺傷率無明顯變化；阻斷hlaⅰ分子，nk細胞對k562細胞殺傷率無明顯變化，對u251細胞的殺傷率明顯上升。

    2.3  k562、u251細胞mica/b和ulbp1～3基因的表達情況  兩種細胞在mrna水平均表達5種基因，見圖1。

    2.4  k562和u251細胞表面mica、ulbp1～3和hlaⅰ分子的表達情況，見表3、圖2。

    3  討論

    nk細胞是天然免疫的主要承擔者，是機體抗腫瘤免疫的第一道天然防線。nk細胞功能的發揮由其細胞表面活化性和抑制性受體傳遞的信號共同決定[4]。nk細胞表面主要抑制性受體為殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(kir)，其共同特征是胞質區末端含有免疫受體酪氨酸抑制基序(itim)，其配體為mhcⅰ分子。當抑制性kir與mhc分子結合后，引起kir分子在胞膜中聚集，使itim的酪氨酸磷酸化，向nk細胞傳遞抑制性信號，使其不殺傷靶細胞[5]。nk細胞表面活化性受體大致分為兩大類，一類是mhcⅰ類分子特異性受體；另一類是非mhcⅰ類分子特異性受體，包括c型凝集素受體

    1：dna marker；2：mica（635bp）；3：micb（690bp）；4：ulbp1（319bp）；5：ulbp2（327bp）； 6: ulbp3（321bp）；7：βactin (510bp)

    圖1  u251、k562細胞mica/b和

    ulbp1～3 mrna的表達情況

    和自然細胞毒受體(ncr)。nkg2d是c型凝集素受體超家族中的成員[6]，是nk細胞表面重要的活化受體，其配體為mica/b和ulbp1～3。nkg2d與腫瘤細胞表面的配體分子相互交聯后，可以直接活化nk細胞，觸發nk細胞的細胞毒活性，在腫瘤免疫監視中起著非常重要的作用。

    本研究結果顯示，同一效靶比時nk細胞殺傷u251細胞的活性明顯低于殺傷k562細胞的活性，兩者之間差異有統計學意義(p＜0.05)。表明以nk細胞殺傷敏感的細胞k562為對照，u251細胞抵抗nk細胞的殺傷。用rtpcr方法檢測發現，k562和u251細胞在mrna水平均表達mica/b和ulbps基因，但流式細胞儀并未在u251細胞表面檢測到mica/b和ulbps分子。另外，流式細胞儀檢測發現u251細胞高表達hlaⅰ類分子，而k562細胞卻不表達。因此可以推測，u251細胞通過hlakir信號途徑向nk細胞傳遞抑制性信號，抑制性信號的參與會提高nk細胞的活化閾值。而u251細胞又不表達所有5個nkg2d的配體，不能向nk細胞傳遞活化性信號。因此與活化性信號相比，抑制性信號明顯占優勢，所以u251細胞抵抗同種異體nk細胞的殺傷。而k562細胞的情況則恰恰相反，其表面缺乏hlaⅰ分子，不會通過hlakir系統向nk細胞傳遞抑制性信號，沒有抑制性信號對活化性信號的對沖，nk細胞活化的閾值就低。同時k562細胞又高表達活化性受體 表2  效靶比20∶1時阻斷靶細胞表面相應分子后nk細胞的殺傷情況表3  u251和k562細胞表面mica/b和ulbp1～3的表達情況 圖2  k562細胞和u251細胞表面nkg2d的配體和hlai類分子的表達情況

    nkg2d的5種配體，因此任何同種異體nk細胞都表現出對k562細胞有很強的殺傷力。在效靶比為20∶1時我們用w6/32抗體阻斷腫瘤細胞表面的hlaⅰ分子后，nk細胞對u251細胞的殺傷能力明顯上升，而對k562細胞的殺傷活性沒有明顯變化。用amo1、bmo1、m295、m310和m551抗體分別封閉靶細胞表面的相應配體，結果顯示，nk細胞對k562細胞的殺傷能力明顯降低，而對u251細胞的殺傷活性沒有明顯變化。說明nkg2d配受體和hlakir信號系統確實參與調節nk細胞對u251細胞的殺傷作用，也證實了我們上述的推理。但抗體阻斷試驗并沒有完全阻斷nk細胞殺傷k562細胞的活性，說明除了nkg2d介導的殺傷活性外，尚有其他信號通路參與nk細胞對其的殺傷作用。

    本實驗結果和friese等[3]的研究一致。friese等發現人神經膠質瘤細胞ln229雖然表達mica，但由于該類腫瘤細胞高表達hlaⅰ類分子，因而對nk細胞抵抗。將轉染mica基因的ln229細胞(ln229/mica)和未處理的ln229細胞接種于裸鼠皮下，發現ln229/mica腫瘤生長明顯延遲，體積明顯縮小。該研究表明增強nk細胞活化性信號，可以對抗抑制性信號，提高nk細胞的細胞毒活性。另外本研究發現u251細胞在mrna水平表達mica/b和ulbp基因，但細胞表面mica/b和ulbp蛋白的表達率極低。因此，研究如何使這些基因轉錄成蛋白表達在膠質瘤細胞表面，或者降低膠質瘤細胞的hlaⅰ分子，增強nk細胞的殺傷活性，將會為尋找新的免疫治療方案提供新的思路。 

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