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摘要：細胞膜片技術是一種無支架的組織工程技術，主要通過調節細胞的培養溫度獲取連接緊密的活細胞組織片與自分泌的細胞外基質，可以完整保留細胞表面的關鍵蛋白，如離子通道、生長因子受體、細胞間連接蛋白。由于無需外源支架材料，能夠避免排異及倫理等問題，可有效彌補現有修復材料的不足。通過檢索近5年的國內外公開發表的文獻，發現細胞膜片被廣泛應用于泌尿系統疾病的治療中，其具有獨特的臨床轉化前景，但截止目前尚未見相關主題的綜述。細胞膜片在尿道與膀胱的修復、急慢性腎損傷、充盈性尿失禁等疾病中被證實有良好的治療效果，但是缺乏進一步的臨床試驗研究。目前尚未檢索到利用細胞膜片修復輸尿管的研究報道。此外，在細胞膜片應用于臨床之后即將面臨細胞膜片的培養周期較長與擇期手術的矛盾以及產業化問題。將來如何妥善保存成熟的細胞膜片以做到隨取隨用也是一項充滿挑戰的研究方向。

關鍵詞：細胞膜片；組織工程；尿道修復；膀胱修復；尿失禁；腎損傷細胞膜片技術（cellsheettechnology，CST）

目前主要被應用于組織工程修復領域，具有廣闊的臨床應用前景[1,2]。近年來，利用質粒轉染、基因編輯等技術對細胞進行改性后培養成細胞膜片，從而加強了其因子分泌功能或使其分泌新的細胞因子，也進一步拓展了細胞膜片的治療手段[3,4]。在臨床治療中，干細胞膜片、上皮細胞膜片和心肌細胞膜片已分別在皮膚、角膜、中耳黏膜和心肌修復的試驗中取得滿意的療效從而得以應用[5-10]。在泌尿系統疾病的治療中，CST在臨床研究中同樣有良好的修復效果，臨床應用潛力正在被不斷發掘。因此，本文將主要闡述CST在泌尿系統疾病治療領域內應用的研究進展。

1CST簡介

近年來，盡管組織工程新型材料不斷涌現并被應用于體內組織的修復再生，但可生物降解支架的降解產物引發炎癥反應和排異反應的風險始終存在[11]。因此，CST被提出來作為一種替代方法。細胞膜片的經典培養方法是將目的細胞高密度接種于溫度敏感型材料包被的特殊培養皿中，并添加相應的生長因子以維持細胞特性及促進細胞外基質分泌[12,13]。這種溫度敏感型材料可以在低臨界溶解溫度下發生親水相/疏水相的快速轉變，即當外界培養溫度由37℃降至20℃時，溫敏培養皿表面的特殊材料可逆地變為親水狀態，發生快速水合和溶脹，完整的細胞膜片即可自動脫落，由此獲得完整的純細胞層片與自分泌的細胞外基質，離子通道、細胞因子感受器和細胞因子受體等成分被完整地保存，有利于維持細胞活性并減少細胞損失及凋亡。另一方面，與細胞膜片相比，同樣不需要支架材料的細胞懸液注射療法具有諸多局限性，例如需要借助溶質、細胞容易流失、細胞存活能力差、體內分布具有不確定性，可造成意想不到的副反應[14]，也無法將細胞定位于治療靶點并發揮最大化的治療效果，從而使其難以達到預期的治療效果。

2CST在尿道修復中的應用

尿道下裂和不同原因引起的尿道狹窄是泌尿外科常見疾病[15,16]。由于缺乏理想的尿道修復替代材料，往往療效不佳，尤其是針對超過3cm的長段尿道狹窄。處理長段尿道狹窄所面臨的主要問題是尋找理想的修復替代材料[17]。傳統構建組織工程尿道的方式包括單純支架材料或細胞支架復合物修復尿道。然而有研究發現，單純支架材料或細胞支架復合物修復尿道時，雖可誘導尿道組織再生，但隨著體內移植時間的推移，部分修復段尿道由于支架材料的吸收導致攣縮感染等并發癥的發生，在修復長段尿道缺損時尤為明顯[18]。支架材料因組織相容性問題及炎癥反應限制了其臨床應用。雖然口腔黏膜或皮瓣移植已被臨床廣泛應用于尿道修復，并能適應尿液暴露環境，但口腔麻木、疼痛、尿道腔內皮瓣毛發的生長等問題始終困擾著患者與臨床醫生[19,20]，所以不需要支架材料的細胞膜片因為可以有效彌補以上不足而被廣泛研究。而來源于膀胱或口腔培養的移植物或上皮細胞膜片也可作為一種備選方式，但其涉及到侵入性操作和額外的損傷區域，供區部位的并發癥也常常給患者帶來額外的痛苦[21]。皮膚上皮細胞膜片的培養和移植可解決上述缺點，它提供充足的上皮細胞，無毛發生長和微創傷，易從包皮或腹股溝區獲取并兼顧美觀需求。ROGOVAYA等[22]利用尿道損傷的新西蘭兔模型，證明移植的皮膚上皮細胞膜片可以成功修復尿道。術后4~7d恢復自主排尿功能，尿道無瘢痕及異常瘺管形成。移植區域術后45d可檢測到熒光標記和尿道標記物UP3共定位的皮膚上皮細胞。此外，細胞膜片的可操作性較強，可以根據實際需要進行排列復合形成具有3D結構的生物材料。ZHOU等[23]利用平滑肌細胞膜片、成纖維細胞膜片和口腔黏膜上皮細胞膜片成功構建了一種全層仿生尿道組織，經過體內預血管化后回植，成功修復犬3cm尿道缺損，首次從實驗上證明了利用CST可以建立3層組織工程化尿道，并能促進再生的尿道形成與正常尿道相似的結構和功能。

3CST在膀胱修復中的應用

膀胱腫瘤、創傷、感染等疾病可引起膀胱功能喪失、容量減少。在膀胱部分切除或全切術后，膀胱擴大或重建新膀胱通常需要使用部分胃腸道以改善患者的生活質量。由于使用胃腸道組織材料可導致額外的手術創傷、術后電解質失衡、結石形成、尿路感染、黏液生成和惡性腫瘤發生等一系列并發癥，因此組織工程細胞膜片作為一種無支架純細胞材料正在被越來越多的研究用于膀胱重建。單層細胞膜片力學強度較弱，用于修復膀胱通暢時需要復合多層或與其他材料相結合以增加其力學強度。此外，若移植前經過充分的血管化可增加膜片的存活率。WANG等[24]利用多層脂肪干細胞膜片構建了一種生物工程3D膀胱補片，并在大鼠模型中評估了其用于膀胱再生的可行性，研究發現組織工程膀胱補片可以修復膀胱功能，促進尿路上皮、平滑肌、神經細胞和血管再生。GUO等[25]取平滑肌細胞和內皮祖細胞共培養，形成體外預血管化平滑肌細胞膜片，然后單層多次埋置皮下形成充分血管化的平滑肌組織瓣，最后用于修復膀胱壁肌肉缺損。該研究證實了預制地血管化平滑肌組織瓣具有可靠的膀胱重建潛力，為3D組織工程材料血管化提供了新的方法。WATANABE等[26]將比格犬口腔黏膜上皮細胞膜片貼于撕去黏膜的胃壁組織瓣上后進行膀胱重建，3周后取修復部位組織瓣行免疫組織學檢查，發現口腔黏膜上皮細胞膜片均存活，新生上皮分層與口腔黏膜相似。

4CST在急慢性腎損傷（acutekidneyinjury,AKI）中的應用

AKI與腎小管壞死、炎癥和血管損傷有關，發病率和死亡率很高[27,28]。據報道，間充質干細胞（mes-enchymalstemcells,MSCs）通過分泌促性腺激素、抗凋亡因子、抗炎因子和免疫調節因子以旁分泌方式減輕腎損傷[29,30]。PARK等[3]報道了一種使用基因編輯的人臍帶間充質干細胞膜片改善大鼠急性腎缺血灌注損傷的方法。與體細胞來源的MSCs相比，臍帶來源MSCs在快速增殖、多次傳代后干性的維持、免疫調節功能等方面更具有優勢。此外，由于AKI發生的突然性，損傷后制備自體細胞膜片在短時間內通常難以完成。在這種情況下，已經進行了預先質量控制可供同種異體移植的臍帶MSCs可立即使用。PARK等[3]通過鋅指核酸酶介導的基因組工程技術，編輯臍帶MSCs增強血管生成因子和抗炎因子的分泌來治療AKI。基因編輯后的臍帶MSCs被培養成為細胞膜片，隨后被貼附于脫去脂肪囊的AKI大鼠腎臟表面。結果表明早期使用細胞膜片療法可以改善腎臟生理功能和組織病理損傷，并且基因組工程化的臍帶MSCs細胞膜片組的治療效果優于靜脈內注射細胞懸液組。有學者指出，該治療方法可能涉及包括全身麻醉、開腹、去除腎臟周圍的脂肪組織甚至打開腎包膜、放置細胞膜片、關腹等過程，可能會進一步加重患者的創傷[31]。因此，在限定的臨床適用范圍內，細胞膜片療法可用于計劃性腎移植手術。腎移植過程本身會引起缺血再灌注損傷，細胞膜片能夠分泌避免繼發性損傷和免疫調節的相關因子，有望改善移植腎的預后[32]。腎臟纖維化是由慢性缺血和炎癥以及儲存尿液致腎小管內壓力升高引起的[33]。在單側輸尿管梗阻（unilateralureteralobstruction,UUO）模型中，腎臟缺氧導致腎小管上皮細胞和腎成纖維細胞發生纖維化反應，隨后加重缺氧，并最終導致進行性纖維化[34-38]。研究表明，外源性給予肝細胞生長因子（he-patocytegrowthfactor,HGF）具有腎臟保護作用[39]。HGF參與血管生成和血管舒張從而改善腎臟血流供應，還可以通過阻斷轉化生長因子-β（transform-inggrowthfactor-beta,TGF-β）信號通路來防止成纖維細胞增殖而抑制纖維化[40-45]。由于肝臟的滅活與消除作用，靜脈用HGF半衰期約5min，最后僅有少量的藥物作用于腎臟[46]。MASATOSHI等[4]首先報道將持續分泌HGF的細胞膜片貼附在腎臟上，用來治療輸尿管梗阻導致的腎纖維化。研究者將HGF質粒轉染的胸膜間皮細胞膜片移植到UUO大鼠腎臟上，結果表明細胞膜片在體內可以持續分泌HGF長達28d，有效抑制了腎臟纖維化。

5CST在尿失禁治療中的應用

壓力性尿失禁（stressurinaryincontinence,SUI）是指在運動和咳嗽等引起腹壓升高的情況下，尿液通過尿道的非自主滲漏。該疾病是一個存在于世界范圍的疾病，影響所有年齡段的患者，常見于女性患者[47,48]。目前，輕中度SUI的治療主要采用盆底肌肉訓練、生物反饋訓練和藥物等保守療法。嚴重的尿失禁通常需要外科手術干預，主要包括注射填充劑、植入吊帶和植入人工尿道括約肌。注射填充劑是SUI的微創治療方法，尤其適合要求低手術風險的老年患者。WANG等[49]利用脂肪干細胞膜片制備了一種脫細胞基質碎片填充劑，并證實了其治療SUI的有效性。研究發現這種新型填充劑1周內與周圍組織完全融合，4周后宿主平滑肌細胞已在注射區域內大量再生，形成新的平滑肌組織。研究認為，脫細胞基質碎片的結構蛋白和附著因子發揮了重要作用，是一種具有臨床轉化前景的微創治療方法。ZOU等[50]則利用骨髓間充質干細胞膜片研制了一種組織工程化吊帶用于治療SD大鼠SUI。研究將40只雌性大鼠隨機分為4組：A組假手術，其余3組均行雙側坐骨神經近端切斷術造模，術后4周測漏點壓力證實為SUI。B組不放置吊帶；C組應用真絲吊帶；D組應用細胞膜片組織工程吊帶。結果顯示，4周后，C組和D組漏尿點壓力幾乎達到A組的正常水平。12周后，D組膠原含量和最大拉力優于C組。研究者認為在大鼠SUI模型中，細胞膜片組織工程吊帶形成了韌帶樣組織，提示其不但未被吸收降解，反而與宿主完全融合并能夠長期發揮作用。作者認為先前的研究將骨髓間充質干細胞懸液直接接種在材料表面或水凝膠中，會導致細胞大量損失、不易存活。因此，將細胞接種在大孔或致密支架上形成細胞膜片再保留完整細胞外基質和細胞因子，還可以增加力學強度，卷曲折疊制成吊帶后治療SUI具有長期療效。

6結語與展望

綜上所述，細胞膜片是一項在組織工程修復領域具有廣泛應用前景的技術。細胞膜片無需酶消化，可以直接收獲具有自分泌細胞外基質的多層細胞薄片，完整地保存離子通道、細胞因子感受器和細胞因子受體等成分，有利于細胞活性的保持并減少移植后細胞的損失及凋亡，已在臨床多個學科中成功應用。雖然細胞膜片在尿道與膀胱的修復中有大量的臨床前研究，但是尚未進一步開展臨床試驗。截至目前，尚未檢索到利用細胞膜片修復輸尿管的研究報道。細胞膜片療法用于治療急慢性腎損傷的適應證范圍及利弊仍然需要探討與權衡。細胞膜片用于治療尿失禁是一個新興的研究方向，展現出良好的臨床應用前景。此外，在細胞膜片應用于臨床之后即將面臨細胞膜片較長的培養周期與擇期手術的矛盾以及產業化問題，將來如何妥善保存成熟的細胞膜片，做到隨取隨用也是一項充滿挑戰的研究方向。

作者：張東亮 單位：上海市第一人民醫院