前言：本站為你精心整理了VITEK2Compact微生物環境監測論文范文，希望能為你的創作提供參考價值，我們的客服老師可以幫助你提供個性化的參考范文，歡迎咨詢。

1材料與方法

1．1材料

1．1．1質控菌株

金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］、銅綠假單胞菌［CMCC(B)10104］、枯草芽胞桿菌［CMCC(B)63501］、大腸埃希菌［CMCC(B)44104］，均由中國食品藥品檢定研究院提供。

1．1．2培養基

營養瓊脂培養基、硫乙醇培養基、改良馬丁培養基、玫瑰紅鈉瓊脂培養皿、麥康凱(MaC)瓊脂培養基、酵母膏胨葡萄糖(YPD)瓊脂培養基、胰酪大豆胨瓊脂(TSA)培養皿、沙氏(SDA)培養皿，均由蘭州生物制品研究所有限責任公司培養基室提供。

1．1．3主要試劑和儀器

革蘭染色液購自美國BD公司;威泰科GP(革蘭陽性)鑒定卡、GN(革蘭陰性)鑒定卡、BCL(芽胞桿菌)鑒定卡、YST(酵母)鑒定卡、0．45%氯化鈉注射液，均購自法國生物梅里埃公司;vitek2compact微生物檢測系統，購自法國生物梅里埃公司;迅數菌落分析—顯微成像一體機，購自杭州迅數科技公司;HPY-300微生物限度過濾系統，購自杭州泰林醫療器械有限公司;麥氏濁度比濁儀，購自法國生物梅里埃公司。

1．2方法

1．2．1質控菌株傳代

將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌和大腸埃希菌的凍干菌粉安瓿掰開，用無菌吸管吸取0．5～0．8mL的營養肉湯培養基，滴加到安瓿中，輕輕旋轉安瓿并吹打，使凍干菌種和液體培養基充分混合并完全溶解。然后將其新鮮培養物接種至營養瓊脂培養基中，于30～35℃培養18～24h傳代(不超過5代);將傳代適應的(不超過5代)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌及大腸埃希菌的新鮮菌落(放置時間不超過24h)，用VITEK2compact進行鑒定分析。

1．2．2純菌鑒定

將用于生產和科研的鼠疫耶爾森菌、布魯菌、肺炎鏈球菌、沙門菌等的傳代菌株培養物新鮮樣本291個進行菌型鑒定，根據可信度結果作為考察其穩定性的一個指標。

1．2．3樣品的采集與制備

主要采集2010—2013年的人員及設備表面微生物、沉降菌、浮游菌及微生物限度樣品共313個。①人員:壓指試驗、表面接觸(頭、胸、手腕、肘、膝蓋)平皿;②設備:表面擦拭;③環境:沉降菌(A級、B級、C級、D級)、浮游菌(A級、B級)。將所有陽性平皿送菌型鑒定;④微生物限度:將生產科室的注射用水和純化水系統水點每周取樣一次，按照中國藥典規定的微生物限度檢測標準操作細則進行。

1．2．4環境微生物菌型檢測

將所培養的單顆菌落或純分的菌落進行菌落特征觀察，經革蘭染色，鑒別其是革蘭陽性桿菌或是球菌、革蘭陰性桿菌或球菌，選用適宜的鑒定卡。然后按照VITEK2Com-pact全自動微生物分析系統儀說明書中的標準操作流程進行測定，一般2～10h給出鑒定結果。

1．2．5菌型結果判斷標準

VITEK2Compact微生物檢測系統的生化鑒定是根據不同微生物的理化性質，采用光電比色法，測定微生物分解底物導致pH改變而產生的不同顏色，來判斷反應的結果，一旦鑒定卡內的終點指示孔到達臨界值，則表明此卡已完成鑒定。系統最后一次讀數后，將所得的生物數碼與菌種數據庫標準菌的生物模型相比較，得到相似系統鑒定值(%)，按此值的大小對檢測可信度作出評價?？尚哦?6%～99%為極好，95%～92%為較好，91%～89%為好，88%～85%為可以接受，85%以下的可信度為低分辨率的鑒別。對于只鑒定到屬的菌株，還需根據報告提示信息進行補充試驗，進一步鑒別到種。

2結果

2．1質控菌株檢測分析

用VITEK2Compact微生物檢測系統對已知的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和大腸埃希菌共4株標準菌株作為質控菌株進行檢測，結果與已知完全相符，可信度在97%以上。

2．2純菌鑒定2010—2013年純菌鑒定樣本291個，

2．3環境微生物數據庫的建立

通過對所收集的環境及制品染菌共313個樣品(其中人員及設備表面微生物25個;沉降菌228個;微生物限度66個)的檢測結果進行整理和分析。共檢出微生物268株，其中人員及設備表面微生物18株;沉降菌188株;微生物限度62株。

2．4不同樣品菌型鑒定結果

對環境檢測樣品(人員及設備表面微生物和沉降菌)及微生物限度樣品檢出微生物的趨勢。結果分析:①人員及設備表面微生物主要以沃氏葡萄球菌、表皮葡萄球菌和玫瑰庫克菌等革蘭陽性菌為主，占72．2%以上，其次是魯氏不動桿菌和少量巨大芽胞桿菌等;②沉降菌樣本以革蘭陽性球菌居多，主要為葡萄球菌屬，藤黃/里拉微球菌，玫瑰庫克菌等，占檢出菌的69．7%，而以少動鞘氨醇單胞菌為主的革蘭陰性桿菌次之，占23．9%。短小芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌等，革蘭陽性芽胞桿菌出現頻率較高為4．8%;③微生物限度檢測樣本以少動鞘氨醇單胞菌、代爾夫特食酸菌及魯氏不動桿菌為主的革蘭陰性桿菌，占檢出菌的40．3%。其次為解甘露醇羅爾斯頓菌、皮氏羅爾斯頓菌均為革蘭陰性短桿菌，占14．5%，霉菌檢出率為9．7%。

3討論

從菌型分析結果可知，生物制劑生產企業潔凈區人員及設備表面微生物及沉降菌樣品檢出率最高的是革蘭陽性菌，而居其首位的藤黃/里拉微球菌和葡萄菌屬，此類菌種為潔凈區環境及人員監測的主要菌群，環境中無處不在，主要存在于人體皮膚表面及呼吸道和口腔的分泌物，均為人員帶入，應做好個人防護，樹立無菌觀念，從根本上降低污染的發生。沉降菌樣品檢出的短小芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌等，主要存在于土壤中，芽胞對熱、干燥、輻射、化學消毒劑和其他理化因素有較強的抵抗力，一般常用的消毒劑很難去除，應選用特殊的強消毒劑。微生物限度所檢出的解甘露醇羅爾斯頓菌、皮氏羅爾斯頓菌為革蘭陰性短桿菌，有芽胞，好氧菌。因封閉的注射用水(80℃保溫循環)和純化水(20℃保溫循環)經多重處理后微生物滋長的營養成分減少，在科室用水的定期微生物限度檢查所出現的超標平皿，應做菌型鑒定并與環境檢測結果作對比，尋找微生物的來源。另外，對于霉菌，從檢出時間和企業所處地域分析，主要出現在濕度較大的南方地區，而對于空氣相對干燥的西北地區霉菌的檢出率更低，但也不容忽視。應對注射用水管道進行滅菌、純化水管道消毒，并在春夏季節加強對各出水口的消毒處理。實驗中是對生物制劑生產過程中微生物污染狀況的初步探索，以法國生物梅里埃全自動微生物分析儀應用于生物制劑生產企業中日常環境微生物監控是十分必要的。該系統具有鑒定快速、準確、自動化程度高、操作簡便、功能廣泛等優點，尤其是GP卡和GN卡研究較為成熟，鑒定準確性最高，可進行快速鑒定。VITEK2Compact微生物檢測系統鑒別含多種細菌的樣本中的不同細菌時，需進行純菌分離直至單顆菌落。革蘭陰性菌，與革蘭陽性菌在難于區分的情況下，可選擇MaC瓊脂作為純化培養基;對于較難培養的菌株，也采用血平板進行純培養。采集的環境微生物由于物理、化學的消殺或暴露了較長時間，菌株可能存在一定的損傷和變異，因此有必要對送檢菌株進行復壯和再次純化。通過菌型分析結果，能夠發現生物制劑生產企業環境中微生物污染的一般規律，在現有環境檢測微生物數據的基礎上建立基因分型的數據庫，可更好地應用于生產過程中的監控。

作者：房世娣趙小潔劉曉凡宣俊文錢秋娟馬軍蘭魏然單位：蘭州生物制品研究所有限責任公司甘肅省疫苗工程技術研究中心