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右旋糖酐(Dextran)又名葡聚糖，是若干葡萄糖脫水形成的聚合物，它作為血容量補充藥已廣泛用于醫療臨床，不同分子量的右旋糖酐具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、抗氧化等活性[1]。右旋糖酐的制備方法有發酵法和酶法。右旋糖酐的產生菌株一般為腸膜明串珠菌[2]。代表性菌株是美國NRRL研究所分離的腸膜明串珠菌NRRLB-512F，該菌株已經被工業化應用。國內右旋糖酐的制備多使用腸膜明串珠菌[3-5]。本文選用購于中國工業微生物菌種保藏中心的腸膜明串珠菌20074，以培養液濁度和pH值作為考察指標，對培養基進行優化。

1實驗部分

1.1主要儀器與材料

UV-4802H雙光束紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司。腸膜明串珠菌：中國工業微生物菌種保藏中心，CICC編號為20074。基礎培養基組成：蔗糖13%(13g/100mL，下同)、蛋白胨0.2%、磷酸氫二鈉0.14%、磷酸二氫鉀0.03%。

1.2實驗方法

1.2.1培養基的配制液體培養基：按照培養基組成稱量藥品，加水加熱煮沸溶解，冷卻到室溫之后定容，調節pH到指定值，將培養基分裝到錐形瓶和試管中，塞好棉塞，用牛皮紙包扎，0.1MPa壓力下滅菌20min，然后自然冷卻。固體培養基：在滅菌之前的液體培養基中加入1.5%~2%的瓊脂，煮沸溶解，分裝之后，塞好棉塞，用牛皮紙包扎，0.1MPa壓力下滅菌20min，然后自然冷卻。

1.2.2菌種活化及保存將安锫管在75%的酒精中浸泡30min，在酒精燈上方烘烤然后滴少許無菌水在瓶口，用鑷子輕輕從瓶口裂痕處敲開，加入0.4mL無菌水，搖動至呈乳濁液，用接種環接種于斜面和平板培養基上，在指定溫度下恒溫活化3d。活化后選擇平板或者斜面上面生長較好的菌落，接種于液體培養基中傳代培養1~2d，即可使用。以上均為無菌操作。菌種保存：活化后液體培養基中培養2~3d的培養液分別接種于斜面上，指定溫度下培養48h，4℃冰箱中保存。菌種保存在斜面上，每1個月轉接1次。首先由斜面轉接到液體培養基中，培養10h，接種到斜面上，培養48h，放入冰箱，4℃保存。

1.2.3基礎培養基組分含量優化分別改變培養基中的蔗糖、蛋白胨、Na2HPO4和KH2PO44種基礎組分的含量，接種量5%，在28℃、100r/min時恒溫搖床培養24h，以起始培養基為空白在λ=450nm時測定濁度，同時測定培養液pH值。各個組分含量的變化如表1所示。

1.2.4培養基中無機氮源的選擇在培養基中加入不同種類和含量的無機氮源，培養條件同1.2.3，以起始培養基為空白在λ=450nm時測定濁度，同時測定培養液pH值。無機氮源的種類和含量的變化見表2。

1.2.5培養基中添加劑的選擇在培養基中加入不同的添加劑，培養條件同1.2.3，以起始培養基為空白在λ=450nm時測定濁度，同時測定培養液pH值。

1.2.6培養基中金屬離子的選擇在培養基中加入不同的金屬離子，選用L16(45)正交表，做正交實驗，培養條件同1.2.3，以起始培養基為空白在λ=450nm時測定濁度，考察金屬離子種類和含量對菌生長的影響。各因素水平見表3。

1.2.7生長曲線的測定將斜面保存的菌接種到液體培養基中，培養10h之后得種子培養液。接種5%的種子培養液到新的培養基中，將接種后的液體培養基分裝于試管中，每支試管5mL。在28℃、100r/min下恒溫搖床培養，每2h取樣1支，以起始培養基為空白在λ=450nm時測定吸光度，同時測定培養液pH值。

2結果與討論

2.1基礎培養基組成對菌體生長的影響

2.1.1蔗糖含量對菌體生長的影響蔗糖在右旋糖酐的制備過程中，是碳源也是底物。蔗糖作為碳源在腸膜明串珠菌20074的作用下產生右旋糖酐蔗糖酶，右旋糖酐蔗糖酶將作為底物的蔗糖轉化成右旋糖酐和果糖。蔗糖含量改變對培養液濁度和pH值影響見圖1。蔗糖含量為10%時，培養液中菌含量達到最大，pH值下降到最低，說明此條件下中菌體生長較好。蔗糖濃度太低可能是底物濃度不足，太高可能會抑制腸膜明串珠菌20074的生長，所以選擇蔗糖含量為10%。

2.1.2蛋白胨含量對菌體生長的影響蛋白胨由蛋白質水解而制得，在細菌的培養中為菌體的生長提供主要的氮源，是細菌培養基應加入的營養物質。蛋白胨含量改變對培養液濁度和pH值影響如圖2所示。當蛋白胨含量增加到0.20%之后，培養液濁度和pH值隨蛋白胨含量的增加變化不大且蛋白胨的增加會增加培養成本。因此，選擇培養基蛋白胨含量為0.20%。

2.1.3Na2HPO4、KH2PO4含量對菌體生長的影響Na2HPO4為菌的生長提供磷和鈉，這2種元素對菌的生長是必需的[6]，同時，Na2HPO4還能對培養液的pH值起到緩沖作用。培養基中Na2HPO4的濃度對培養液濁度和pH值的影響見圖3。雖然含量的增加使培養液濁度增加，但當濃度大于0.20%后培養液濁度下降，說明對菌體的生長產生不利的影響，所以選擇0.20%。K+也是菌體生長必需的元素之一，培養基中KH2PO4的濃度對培養液濁度和pH值的影響見圖4。在本實驗條件范圍內，KH2PO4含量為0.03%時，培養液濁度出現最大值，而且pH值增加速度開始變大，所以選擇基礎培養基中KH2PO4含量0.03%較為合適。

2.2無機氮源含量對菌體生長的影響

菌的生長所需要的氮源包括有機氮源和無機氮源，常用的無機氮源有NH4Cl、(NH4)2SO4、NaNO3等。在培養基中加入無機氮源對菌體生長的影響見圖5、圖6和圖7。NH4Cl的加入使培養液的菌含量有所下降，所以不利于菌體的生長，不應作為培養基的組分加入，pH的下降可能是因為NH4Cl的加入造成的。與NH4Cl相同，培養基中加入實驗所選濃度的(NH4)2SO4同樣會使菌含量下降，而且pH值略有增加，對菌體的生長產生不利影響。盡管一定濃度的NaNO3加入到培養基中使菌含量增加，但是與未加入時相比變化不大，說明NaNO3對菌的生長影響不大。

2.3添加劑對菌體生長的影響

菌體生長除了需要碳源、氮源以及一些無機鹽之外，一定量的添加劑可以為菌體生長提供生長因子，強化菌體的生長。常用的添加劑有番茄汁、玉米汁、牛肉浸膏、酵母浸膏等。實驗選用牛肉浸膏和酵母浸膏作為添加劑，培養結果見圖8、圖9。當加入一定量的牛肉浸膏到培養基中，在相同的培養條件下，培養液的濁度增加不大，培養液的pH值變化也不大。所以，牛肉浸膏對腸膜明串珠菌生長的作用不大。酵母浸膏富含維生素、氨基酸和一些其他營養成分，可為菌體的生長提供所需的生長因子。酵母浸膏含量對菌體生長的影響的實驗結果見圖9，培養液的濁度OD值隨著酵母浸膏含量的增加而增加，培養液的pH值卻明顯下降。可見，酵母浸膏的加入可明顯促進腸膜明串珠菌20074的生長。培養基中酵母浸膏含量大于0.5%時濁度增加速度和pH值下降速度明顯減慢，所以，選擇培養基中酵母浸膏的加入量為0.5%。

2.4金屬離子對菌體生長的影響

金屬離子對腸膜明串珠菌20074生長影響的正交實驗按L16(45)安排進行，結果見表4。培養基其他組成為：蔗糖10%、蛋白胨0.2%、Na2HPO40.2%、KH2PO40.03%、酵母浸膏0.5%。從實驗結果可知，Mn2+離子對菌體生長的影響較大，在實驗所選的范圍內，其他金屬離子對菌體生長的影響不大。

2.5菌體生長曲線

在選擇的培養條件下，以培養液的OD值為指標，測定了腸膜明串珠菌20074的生長曲線，結果見圖10。0~8h內隨培養時間的延長，培養液濁度變化不大，即菌含量變化不大，為腸膜明串珠菌20074生長的延遲期；8~24h內菌含量隨培養時間迅速增加，是膜明串珠菌20074生長的對數期；24h之后，菌含量基本穩定，菌生長達到穩定期；30h開始，菌含量略有下降，菌的生長達到衰亡期。在菌體生長過程中，同時生成一系列生理酸性物質，引起pH值下降。

3結論

對基礎培養基的各組分含量進行優化，得到最優組成為：蔗糖10%、蛋白胨0.2%、磷酸氫二鈉0.2%、磷酸二氫鉀0.03%。無機氮源NH4Cl、(NH4)2SO4、NaNO3不能明顯加快腸膜明串珠菌20074的生長。添加劑酵母浸膏可明顯促進腸膜明串珠菌20074的生長，加入量為0.5%。實驗所選的范圍內，金屬離子中Mn2+對菌體生長的影響較大。腸膜明串珠菌20074的生長曲線表明，0~8h是生長延遲期，8~24h為對數期，24~30h為穩定期，30h之后為衰亡期。